(1.滨海湿地生态系统教育部重点实验室(厦门大学),福建 厦门 361102; 2.厦门市园林植物园,福建 厦门 361003)
(1.Key Laboratory of the Coastal and Wetland Ecosystems(Xiamen University),Ministry of Education,Xiamen 361102,China; 2.Xiamen Botanical Garden,Xiamen 361003,China)
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.202002025
世界十大最毒污染问题中有4项与重金属铅(Pb)直接相关,非必需营养元素Pb已被列为最危险的环境污染物之一[1-2].美国环境保护署(USEPA)指出重金属Pb应作为重点监控对象,且当土壤中重金属Pb含量超过400 mg/kg时应加以修复处理[3-4].USEPA提议含磷材料是重金属Pb得以钝化修复的最佳选择,大量研究也证实其与重金属Pb之间可通过吸附、络合、离子交换、沉淀等反应形成迁移能力差、溶解度低的低毒或无毒物质[3,5-7].
含磷材料的溶解度是该钝化修复技术的关键,含磷材料供给自由磷酸根离子的能力与其钝化修复效率息息相关[7-8].然而,磷不仅是生物生长和发育的营养物质,也是常见的环境污染物质之一[9].可溶性磷酸盐的大量使用极易引发环境的二次污染,导致水体富营养化、土壤酸化和植物营养失衡等问题[3,8,10-11].已有研究表明,常被废弃的中低品位磷矿粉(后简称磷矿粉,PR)可成为可溶性磷酸盐的替代品,具有成本低、易获取的优势,对土壤pH影响小,可能造成的水体富营养化等环境风险小,是大范围环境污染长期修复的最佳选择[5,12-13].然而,PR的化学钝化修复效率常受到溶解度低的抑制[3].Chrysochoou等[7]对大量文献加以总结后提出,含磷材料作为钝化重金属Pb最佳修复剂的方式仍需进一步商榷; 同时,Govarthanan等[14]指出,单一化学修复方式存在修复效率低等诸多不足.
真菌对生物必需元素或有毒金属元素的生物地球化学循环至关重要,影响多种元素的迁移能力和生物有效性,从而导致次生矿物的产生或有毒金属物质的固定.解磷真菌作为解磷微生物中解磷能力强且性能稳定的重要组分,通过自身代谢活动将难溶性或不溶性无机或有机磷酸盐转化为具生物活性的磷酸盐形式[15].该类功能菌从PR中释放的自由磷酸根离子,对弥补PR的低溶解度问题和提升重金属Pb钝化修复效率具有巨大的应用潜力.然而,目前的研究更多关注于含磷材料对重金属的化学钝化效果和机理,而解磷微生物尤其是解磷真菌在该领域的应用报道鲜少.Park等[10,16]将解磷细菌与PR结合应用于钝化修复重金属Pb污染的土壤,Li等[17]尝试将解磷真菌Aspergillus niger和氟磷灰石结合使用,结果都发现二者联用可有效钝化重金属Pb.然而,不同种类的解磷菌株联合PR的钝化修复效果仍未知.
本研究基于解磷真菌对PR的溶解能力和重金属Pb的耐受能力,从红树植物根际沉积物中筛选适用于滨海湿地重金属修复的工程菌,进而探讨耐Pb解磷真菌联合PR对重金属Pb的钝化修复效果.
采用NBRIP(National Botanical Research Institute's phosphate)固体培养基筛选的方法[18],从福建省漳江口国家红树林自然保护区、海南省东寨港国家红树林自然保护区、台湾省挖仔尾红树林自然保护区的秋茄(Kandelia obovata)根际沉积物(0～20 cm)中分离和筛选解磷真菌.NBRIP固体培养基组分为(g/L):10.00葡萄糖、0.10硫酸铵、0.25七水合硫酸镁、5.00六水合氯化镁、0.20氯化钾、5.00磷酸钙、15.00琼脂,pH调节至7.2.待培养基冷却至45～50 ℃时,添加25 mg/mL链霉素和25 mg/mL青霉素(阿拉丁试剂(上海)有限公司,分析纯)以抑制细菌生长[19],利用是否产生明显透明解磷圈初筛解磷真菌.
经过14 d培养后,挑选在初筛固体培养基中出现明显透明解磷圈的真菌菌株,进行多次纯化直至获得纯菌株; 将菌株在4 ℃条件下保存备用,同时添加20%(体积分数)甘油和5%(质量分数)海藻糖后于-80 ℃ 条件下长期保存.通过光学显微镜(徕卡,DM500)观察菌株的形态特征和转录间隔区序列(ITS)分析方法[20]鉴定菌种,利用真菌基因组DNA提取试剂盒(索莱宝)提取菌株的基因组DNA,并采用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[20]送至厦门精聚科技有限公司测序,获得的测序结果在GenBank数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中Blast比对以确定菌种类型.
PR(过100目筛)购自贵州瓮福磷矿厂,按照常规方法分析其主要性质如下:pH为6.2,总磷质量分数为28.51%,2%(质量分数)柠檬酸可提取的有效磷质量分数为5.29%.
参照Park等[16]的方法测定供试菌株对PR的溶解能力,具体操作如下:将菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基中培养5～7 d后,将孢子轻轻刮下制成孢子悬液(1×107 cfu/mL,cfu为菌落形成单位),然后按体积分数1%将其添加到含有0.1 g 磷矿粉的20 mL NBRIP液体培养基中,在(28±2)℃条件下160 r/min恒温振荡培养.以等量无菌水替代孢子悬液作对照处理,将经过7 d培养的培养液于4 000 g 离心后获得上清液,利用pH计(上海雷磁仪器有限公司)测定pH值,并参照Murphy等[21]的方法测定上清液中可溶性磷酸盐的含量.
采用添加有不同Pb浓度梯度的SLP(sucrose-minimal salts low-phosphate)固体培养基[22]分析解磷真菌在固体培养基中对重金属Pb的耐受能力.该培养基主要组分为(g/L):10.0蔗糖、0.1氯化钠、0.5磷酸氢二钾、0.5硫酸镁、0.5酵母提取液、1.0硫酸铵、15.0琼脂,pH调节至7.2.事先制备质量浓度为104 mg/L的Pb母液(以Pb(NO3)2的形式加入),灭菌处理后按要求加入上述培养基中,然后接种已在PDA固体培养基中生长7 d的菌落直径8 mm的真菌,所有处理设3个重复,在(28±2)℃条件下培养14 d后观察菌株生长情况,其中供试菌株在固体培养基中无法生长的浓度定义为最小抑制浓度(MIC).
为了进一步分析供试菌株在液体培养条件下对重金属Pb的耐受能力,向装有10 mL马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基的50 mL离心管中添加适量Pb溶液,使得培养液中Pb的终质量浓度分别为0,200,500 和800 mg/L.按体积分数1%接种供试菌株的孢子悬液(1×107 cfu/mL),在(28±2)℃条件下160 r/min恒温培养10 d,所有处理设3个重复.最后,将培养液在9 000 g条件下离心10 min,用事先冻干的Whatman No.1滤纸过滤获取菌丝体,再用无菌水清洗3～5次后冷冻干燥,称得菌丝体的干质量.计算菌株的重金属耐受系数IT[23]:IT=mt/m0,式中,mt为不同浓度Pb处理下菌株的干质量,m0为无Pb处理下菌株的干质量.
将PSF-FJ1、PSF-TW、PSF-FJ3和PSF-HN 4株解磷真菌用于修复Pb污染水溶液体系.首先,在50 mL PDB液体培养基中加入0.5 g PR,再加入适量Pb溶液,调节培养液中Pb的终质量浓度分别为200和800 mg/L,然后分别接种1 mL孢子菌悬液(1×107 cfu/mL),共设置4个处理:+PR+FJ1、+PR+TW、+PR+FJ3和+PR+HN.同时设计两组对照:1)为确定培养介质中各组分对溶液中Pb含量的影响,不添加PR也不接种菌剂,即对照1(-PR-PSF); 2)为确定单一PR处理对Pb钝化修复的效果,添加等量PR但不接种菌剂,即对照2(+PR-PSF).所有处理在(28±2)℃和160 r/min条件下进行培养,设3个重复处理,对照组则添加等量无菌水.分别在第2,4,6和7 d取培养液经4 000 g离心30 min后过0.22 μm滤膜(索莱宝),用原子吸收分光光度计(Model AA-6800,日本)分析培养液中可溶性磷酸盐含量和残留Pb质量浓度.
以磷酸钙为唯一磷源时,从福建、海南、台湾三地的红树林根际沉积物中分离和筛选出13株解磷真菌,并进一步分析这些真菌菌株对PR的解磷能力.由表1可知,与未接种处理相比,菌株PSF-TW表现出最强的解磷能力,高达(160.77±6.92)mg/L,其次为菌株PSF-FJ1,解磷能力为(155.41±2.73)mg/L.伴随着菌株的生长和可溶性磷酸盐含量的变化,所有菌株都使得培养液的pH明显降低.Achal等[24]的研究指出,
表1 解磷真菌在含PR的NBRIP液体培养基中的解磷能力
Tab.1 phosphate-solubilizing capacity of phosphate-solubilizing fungi in NBRIP liquid medium with PR
利用紫外线照射获取的A. tubingensis表型突变体AtM-5和AtM-2,可分泌酸性磷酸酶和植酸酶来降低培养液的pH,从而有效溶解PR.从印度奥里萨邦重金属矿区中筛选出的解磷真菌Penicillium sp.21和Penicillium sp.2,与解磷细菌相比具有更高的产酸效率,也表现出更强的PR溶解能力[25].
除了解磷能力之外,菌株的重金属耐受能力在重金属污染水体修复中亦至关重要.如表2所示,在SLP固体培养基中,当Pb质量浓度低于200 mg/L时,重金属Pb对菌株的抑制效果不明显,说明供试菌株对Pb具有一定的耐受能力; 但当Pb质量浓度达到1 000 mg/L时,菌株PSF-FJ2、PSF-FJ7和PSF-FJ9已无法生长,菌株PSF-FJ4、PSF-FJ10和PSF-FJ11的生长则受到明显抑制; 菌株PSF-FJ3、PSF-FJ1、PSF-TW和PSF-HN对Pb的耐受能力最强,甚至在Pb质量浓度高达2 500 mg/L时仅受到轻微抑制.Babu等[26]从含Pb尾矿中筛选出耐受能力强的青霉属Penicillium sp.PDR1～3、镰刀菌属Fusarium sp.PDR1～16和木霉属Trichodermasp.PDR1～7,它们在固体培养基中对Pb的MIC范围为1 700～2 100 mg/L.
表2 不同Pb质量浓度对SLP固体培养基中解磷真菌生长情况的影响
Tab.2 Influence of different Pb concentrations on growth of phosphate-solubilizing fungi on SLP solid medium
如图1所示,高质量浓度Pb使得多株解磷真菌的菌丝体颜色由白色或浅黄色转为褐色或黑褐色,且大部分真菌菌株在生长后期的孢子形成受到严重抑制.这与Huang等[27]的研究结果类似,在400 mg/L Pb的胁迫环境下,与对照处理相比,木质素降解菌Phanerochaete chrysosporium的菌丝体由最初的规则乳白色变成不规则的黄色短菌丝,真菌菌株可通过改变菌丝密度和菌丝分泌物等对Pb胁迫作出响应.本研究也发现部分菌株在生长后期形成深色分泌物.
本研究采用Jiang等[22]方法中的SLP固体培养基对供试菌株的Pb耐受能力进行分析,尽管已选用低磷含量的培养基,但Pb的加入仍无法避免白色沉淀的产生,该结果表明固体培养基中Pb的实际有效态含量低于预设浓度,因此供试菌株的MIC值将被高估.此外,经过较长时间的培养,部分解磷真菌如PSF-HN(图1(c))菌落中央出现一定程度的溶解现象,说明随着培养基中养分的消耗,部分菌株会重新活化原先被培养介质固定的Pb.
(a～c)解磷真菌PSF-HN:(a)为PDA培养基中菌株的形态,
(b)(正面)和(c)(背面)为Pb质量浓度2 000 mg/L的
SLP培养基中菌株的形态,红色箭头示意透明溶解圈;
(d～f)解磷真菌PSF-FJ11:(d)为PDA培养基中
菌株的形态,(e)(正面)和(f)(背面)为Pb质量
浓度2 000 mg/L的SLP培养基中菌株的形态.
图1 重金属Pb对解磷真菌形态的影响
Fig.1 Influence of heavy metal Pb on morphological characteristics of phosphate-solubilizing fungi
综合考虑供试菌株对PR的溶解能力和对Pb的耐受能力,优选菌株PSF-FJ1、PSF-FJ3、PSF-TW和PSF-HN进行后续研究.基于形态学特征
图2 4株供试解磷真菌在PDA培养基中的形态特征
Fig.2 Morphological characteristics of the four selected phosphate-solubilizing fungi on PDA medium
(图2)和分子鉴定结果,PSF-FJ1、PSF-FJ3、PSF-TW和PSF-HN这4株解磷真菌分别被鉴定为Penicillium sp.PSF-FJ1、Penicillium sp.PSF-TW、Aspergillus niger PSF-FJ3和A. aculeatus PSF-HN.
SLP固体培养基常被用于分析微生物对重金属Pb的耐受能力[22,28-35],但其中的0.05%(质量分数)磷酸根离子和0.15%(质量分数)硫酸根离子会与重金属Pb反应形成白色沉淀物.与重金属总量相比,微生物对游离金属离子的含量更敏感[10].Saeki等[32]的研究也指出,重金属的有效态含量对微生物生长的影响远比重金属总量更重要.因此,本研究参照Deng等[33]的方法尝试使用PDB培养基,但仍无法避免白色沉淀物的产生.
图3 4株供试解磷真菌在不同Pb质量浓度的液体培养基中的耐受系数
Fig.3 Tolerance indexes of the four selected phosphate-solubilizing fungi in liquid medium of different Pb mass concentrations
如图3所示:在200 mg/L Pb的液体培养条件下,PSF-FJ1、PSF-TW、PSF-FJ3和PSF-HN这4株解磷真菌的重金属耐受系数IT均达到0.6以上,其中菌株PSF-FJ3对Pb的耐受系数最高; 当培养液中Pb的质量浓度达到500 mg/L时,菌株PSF-FJ3仍表现出最高的耐受系数,但菌株PSF-FJ1的生长则受到明显抑制; 随着培养液中Pb质量浓度的提高,所有菌株的生长都受到不同程度的抑制.此结果与Park等[10]的研究结果一致,培养液中有效态Pb的实际含量低于初设浓度.同时通过比较可见,菌株在固体培养基和液体培养条件下对Pb的耐受能力有所差异,在Pb质量浓度低于1 000 mg/L的固体培养基中,4株菌株的生长只受轻微抑制作用,菌株甚至在Pb质量浓度高达2 500 mg/L的固体培养基中仍存活较好.
从图4可见,不接种菌剂的对照处理水溶液培养体系(-PR-PSF 和+PR-PSF)中,无论是否添加PR都可检测到一定量的可溶性磷酸盐,且更高浓度的Pb溶液中可溶性磷酸盐的含量会进一步降低.培养介质组分(尤其是磷酸盐)会固定部分游离Pb离子,
图4 不同处理组在200 mg/L(a)和800 mg/L(b)重金属Pb添加水平下的可溶性磷酸盐含量
Fig.4 Contents of soluble phosphate under 200 mg/L(a)and 800 mg/L(b)of heavy metal Pb in different treatment groups
导致Pb的实际含量低于初始设定浓度,如Pb初设质量浓度为200 mg/L时检测到的实际值只有约50 mg/L,Pb初设质量浓度为800 mg/L时检测到的实际值也仅约260 mg/L.
在不同Pb质量浓度下,与不接种处理相比,PSF-FJ3的参与不仅不能提高溶液中可溶性磷酸盐的含量,反而因大量菌丝体的生长消耗了培养体系中的可溶性磷酸盐; 而PSF-HN虽在Pb质量浓度较低(200 mg/L)时可高效溶解PR,但当Pb质量浓度达到800 mg/L时则丧失解磷能力,菌丝体的生长同样消耗了溶液中原有的少量可溶性磷酸盐.由此可见,Pb胁迫会抑制部分解磷真菌的解磷功能.Pérez-Rama等[34]的研究也指出,当培养液中的Cd质量浓度从0.6 mg/L提高到45 mg/L时,菌株Tetraselmis suecica开始呈现重金属Cd的毒害作用.
与菌株PSF-FJ3和PSF-HN不同的是,菌株PSF-FJ1和PSF-TW通过自身代谢活动从PR中释放大量可溶性磷酸根离子,使得溶液中的可溶性磷酸盐含量显著增加; 然而,高质量浓度(800 mg/L)Pb胁迫导致解磷真菌达到最高解磷量所需的培养时间延后,在培养至第6天时,培养液中的可溶性磷酸盐含量才迅速上升.
本研究发现PR可在一定程度上降低溶液中Pb离子的含量,但单一PR处理的钝化能力有限,PR的低溶解度会抑制其对重金属的钝化修复效率(图5和图6).如图5(a)和6(a)所示,当Pb质量浓度为200 mg/L时,随着菌株的菌丝体生长和代谢活动,4株菌株的参与都使得溶液中残留Pb含量降至极低水平,重金属Pb得以有效固定,可见解磷真菌在较低水平的胁迫环境下对Pb的钝化能力与其解磷能力不成正比.微生物的吸附作用是其钝化重金属的重要机制,Yang等[35]和Chen等[36]的研究结果显示,一株分离自红树林土壤中的内生真菌菌株Fusarium sp.#ZZF51,通过自身的吸附作用有效钝化重金属U(Ⅵ).从生长在重金属污染土壤的Brassica chinensis根系中分离出的Pb和Cd耐受
图5 不同处理组在200 mg/L(a)和800 mg/L(b)重金属Pb添加水平下残留的Pb含量
Fig.5 Contents of residual Pb under 200 mg/L(a)and 800 mg/L(b)of heavy metal Pb in different treatment groups
图6 不同处理组在200 mg/L(a)和800 mg/L(b)重金属Pb添加水平下Pb的修复效率
Fig.6 Pb removal efficiency under 200 mg/L(a)and 800 mg/L(b)of heavy metal Pb in different treatment groups
内生真菌Mucor sp.CBRF59,可通过菌丝体中细胞膜的运转作用实现Cd和Pb在细胞内的积累[33].此外,Li等[17]借助X射线衍射和扫描电子显微镜-能谱技术,发现菌株A.niger在溶解氟磷灰石时分泌的草酸代谢物可与重金属Pb反应生成草酸铅沉淀,从而有效去除溶液中的Pb离子.在较低污染水平的重金属胁迫环境中,本研究优选的4株解磷真菌可通过菌丝体的生物吸附或代谢产物的分泌有效实现重金属Pb的钝化修复,从而利用功能微生物的大量繁殖实现污染环境的持续修复.
然而,在200 mg/L Pb胁迫条件下,与丧失PR溶解能力的菌株PSF-FJ3相比,保留有解磷能力的其他3株菌株可在更短时间内实现Pb的钝化修复,菌株溶解PR释放的自由磷酸根离子有助于在更短时间内实现钝化修复效果.随着培养时间的延长,PSF-TW、PSF-FJ3和PSF-HN因大量菌丝体生长对营养物质需求的增加,会重新释放原先被固定的重金属Pb,这与长时间培养后菌株在含Pb的SLP固体培养基上菌落中心区域形成明显溶解圈的现象一致.营养物质的大量消耗会加速菌株的死亡[37],有些解磷细菌可将原先反应形成的难溶性含Pb复合物Pb5(PO4)3Cl等作为磷源供自身生长需要[38-39],再次活化重金属Pb,原先吸附在菌丝体的Pb或与有机酸螯合的Pb有被重新释放到溶液中的风险.因此,利用微生物技术钝化修复重金属时,不可忽略修复周期和生长环境中的营养状况等重要因素.
微生物对重金属的修复效率受到重金属浓度的影响,菌株自身对重金属的生物吸附能力有限,如Yan等[40]、Chen等[41]和Deng等[33]的研究发现,菌株对Pb的吸收量在35.7～50.9 mg/g之间.当重金属污染水平超过微生物的吸附能力,为了适应高浓度的重金属胁迫环境,有些菌株通过合成酶或金属结合肽来缓解重金属毒害作用,进一步提高细胞对重金属的吸收能力[33].如图5(b)和6(b)所示:当Pb质量浓度达到800 mg/L时,菌株PSF-HN在培养前期随着菌丝体的生长表现出对Pb浓度的进一步降低效果; 但累积到一定程度后,菌株细胞对有毒金属的外排作用占主导[33].与Park等[16]在液体培养体系中的研究结果相似,在高浓度Pb胁迫环境中丧失解磷能力的曲霉属菌株PSF-FJ3和PSF-HN无法实现对水溶液体系中Pb的钝化修复,反而活化了原先被培养体系或PR钝化的部分Pb离子.
除了传统的非特异性生物吸附作用之外,真菌菌株通过代谢过程介导形成低溶解度的铅矿物沉淀是重金属Pb得以钝化修复的另一种重要机制[1].Sowmya等[42]从印度重金属污染土壤中筛选出的耐U(Ⅵ)解磷细菌(Acinetobacter sp.YU-SS-SB-29),通过代谢分泌的有机酸溶解难溶性磷酸钙盐后,释放出的磷酸根离子可与重金属U(Ⅵ)形成黄色的磷酸铀矿物沉淀.本研究在高质量浓度Pb胁迫环境中,经过6 d培养后,保留PR溶解功能的2株青霉属菌株(Penicillium sp.PSF-FJ1和Penicillium sp.PSF-TW)将溶液中Pb含量迅速降低至极低水平,溶液中残留的Pb质量浓度分别仅为(4.93±0.44)mg/L和(5.37±0.37)mg/L,Pb的钝化修复效率分别达到98.10%和97.93%.两株解磷真菌从PR中释放出的大量可溶性磷酸盐,与溶液中游离的Pb离子发生钝化反应,可高效钝化修复重金属污染的水溶液,实现水体净化.本研究中青霉属菌株的生长导致培养体系的酸化,部分pH甚至降低到4.2以下(结果未展示),但与Park等[10]的研究结果不同,酸化现象并未抑制解磷真菌对重金属Pb的钝化修复能力.该结果可归因于解磷真菌的菌丝生物量远超于解磷细菌的生物量,菌丝体表面有大量吸附位点,且解磷真菌比解磷细菌具有更高的解磷能力,供试菌株供应自由磷酸根离子的能力可实现水溶液体系中重金属的钝化修复.
上述结果表明,解磷真菌对重金属Pb的钝化修复效率与菌种类型、修复周期、生长环境营养状况和重金属污染水平等密切相关.由于滨海湿地高盐、酸性等生境特殊性,从红树根际微区域中筛选出的2株青霉属解磷真菌(Penicillium sp.PSF-FJ1和Penicillium sp.PSF-TW)在联合PR钝化修复重金属Pb污染方面更具优势.同时,这两株青霉属解磷真菌具产生植物生长素和铁载体的潜力(结果未展示),可作为农业有益菌强化植物修复重金属污染的能力.
本研究从福建省、海南省、台湾省三地红树根际微区域中筛选出4株耐Pb解磷真菌(Penicillium sp.PSF-FJ1、Penicillium sp.PSF-TW、A.niger PSF-FJ3和A.aculeatus PSF-HN).然而,过高质量浓度的重金属Pb胁迫会抑制解磷真菌A.niger PSF-FJ3和A.aculeatus PSF-HN对PR的解磷能力.解磷性能稳定的解磷真菌Penicillium sp.PSF-FJ1和Penicillium sp.PSF-TW联合PR的修复方式,可有效实现重金属Pb的钝化修复从而净化重金属Pb污染水体.该联合修复技术为高浓度重金属污染水体的修复提供了新思路.耐Pb解磷真菌Penicillium sp.PSF-FJ1和Penicillium sp.PSF-TW可作为重金属修复工程菌种资源,后续有待进行深入研究.
