基金项目:国家自然科学基金(31571896); 福建省教育厅科技B类项目(JB14209); 漳州卫生职业学院自然科学项目(ZWYZ201807)
通信作者:yshi@xmu.edu.cn
(1.漳州卫生职业学院基础医学部,福建 漳州 363000; 2.厦门大学生命科学学院,福建 厦门 361102)
(1.Faculty of Basic Medicine,Zhangzhou Health Vocational College,Zhangzhou 363000,China; 2.School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)
Gynura formosana Kitam.; total flavonoids; cell proliferation; cell cycle; cell apoptosis
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201807007
研究了白凤菜(Gynura formosana Kitam.)总黄酮(TFG)对肝癌HepG2细胞的生长、增殖和凋亡的影响.噻唑兰(MTT)实验结果表明TFG对HepG2细胞体外增殖的抑制作用有浓度和时间依赖效应:处理24 h后130和260 μg/mL TFG实验组的HepG2细胞凋亡率均显著升高,分别达到(47.00±1.31)%和(76.39±1.39)%(p<0.05); 24 h的半抑制质量浓度(IC50)为190.80 μg/mL.实验组HepG2细胞周期阻滞在S期,细胞迁移率随TFG质量浓度的升高而下降,细胞内活性氧(ROS)水平最终显著下降至对照组的6.9%(p<0.05),细胞中Bax表达量略微上调而Bcl-2表达量明显下调.综上,TFG抑制肝癌HepG2细胞增殖和诱导HepG2细胞凋亡的机制可能与下调细胞ROS水平、重构细胞内还原体系、上调促凋亡蛋白Bax以及下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达相关.
This paper investigated the effects of total flavonoids of Gynura formosana Kitam.(TFG)on the growth,proliferation and apoptosis of hepatoma HepG2 cells.The MTT assay detected that TFG had dose- and time-dependent effects on the proliferation inhibition of HepG2 cells.The apoptosis rates of HepG2 cells treated with TFG of 130 μg/mL and 260 μg/mL increased significantly to(47.00±1.31)% and(76.39±1.39)%,respectively(p<0.05),and the half-concentration of inhibition(IC50)in 24 h was 190.80 μg/mL.In the TFG-treated groups, the HepG2 cell cycle was remarkably retarded and stayed in S phase and the cell mobility decreased with the increasing TFG concentration; the reactive oxygen species(ROS)levels of the HepG2 cells finally declined to 6.9%(p<0.05); the Bax expression in cells was slightly up-regulated and Bcl-2 expression was obviously down-regulated.Taking together,the mechanism inhibiting the proliferation and inducing the apoptosis of HepG2 cells may be related to the reduction in the ROS levels,the rebuilding of the intracellular redox system,the up-regulation of apoptosis promoting protein Bax and down-regulation of apoptosis inhibiting protein Bcl-2.
肝癌在世界常见癌症中排第五位,分别是男、女性死于癌症的第二和第六大原因[1].在中国,肝癌在所有恶性肿瘤发病率中排第四位,死亡率排第二位[2].对于早期肝癌患者,手术治疗是首选; 而对于大多数晚期肝癌患者及复发患者,系统化疗是重要治疗手段之一.然而,目前的化疗药物虽然能有效抑制肿瘤,但是副作用较强,很多患者难以耐受药物引发的副作用.
植物总黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、防治糖尿病、保护心血管和消化道等多种活性[3-6],毒副作用相对较小,具有抗肿瘤药物开发的潜在价值.近年来,黄酮等天然产物逐渐成为抗癌药物开发的热点.马鞭草(Vernena officinalis L.)总黄酮可有效抑制肝癌HepG2细胞的增殖,降低HepG2细胞侵袭力,并呈现明显的浓度依赖性[5,7]; 高良姜(Alpinia officinarum Hance.)总黄酮能明显抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖,同时可诱导细胞凋亡[8].黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi.)黄酮类化合物作用于HeLa细胞后,细胞的增殖和迁移能力均受到明显抑制,同时处于S期的细胞比例增大,且呈现时间与剂量依赖性[9].
白凤菜(Gynura formosana Kitam.)又名肝炎菜,菊科千里光族三七属,原产自台湾岛,药食同源,全草可入药,通常是采集后切断鲜用或晒干备用,较少使用炮制品.全草有清热利尿、活血化瘀、舒经活络和解毒消肿的功效; 煎服可治疗咽喉炎、气管炎、中耳炎、高血压、肝炎、肺炎、风湿关节炎、咳血和便血等; 外用主治外伤出血、跌打外伤、乳腺炎和阴道炎等[10].三七属植物多含生物碱、黄酮和挥发性萜类活性成分,然而关于白凤菜总黄酮(TFG)的抗肿瘤活性研究目前还未见报道.
本研究通过不同浓度TFG作用于肝癌HepG2细胞后,观察细胞的生长形态、存活率、迁移能力以及细胞周期和细胞凋亡情况,并通过检测细胞内活性氧(ROS)水平及细胞内Bax和Bcl-2蛋白含量的变化,探讨了TFG对肝癌细胞的影响及可能作用机制.
试剂:DMEM高糖培养基(上海Sangon公司),胎牛血清(澳大利亚AusGeneX公司),RNase A(北京全式金生物技术公司),青链霉素混合液(美国Hyclone公司),HP-20大孔树脂(北京绿百草科技发展有限公司),滤膜(上海Sango公司),0.25%(质量分数)胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)消化液(美国Hyclone公司),ROS检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所),碘化丙啶(PI,上海Sangon公司),Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(BBI公司),噻唑兰(MTT)干粉(美国Sigma-Aldrich公司),吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色试剂盒(上海碧云天生物技术研究所); BCA(bicinchoninic acid)蛋白检测试剂盒(上海Sango公司),β-actin(辣根过氧化物酶(HRP)偶联)一抗、Bax一抗、Bcl-2一抗和HRP标记的小鼠抗兔二抗(上海Sango公司),HRP-增强型化学发光(ECL)试剂盒(北京康维世纪公司).其他试剂均为国产分析纯.
仪器:流式细胞仪Beckman Coulter FC500(美国),倒置相差显微镜Nikon TE2000(日本),pH计METTLER TOLEDO FE20(美国),全波长酶标仪Thermo Fisher MULTISKAN GO(美国),凝胶成像仪GE Image Quant LAS 4000 mini(美国).
白凤菜乙醇提取液转入大孔树脂柱,用70%(体积分数,下同)乙醇洗脱,将洗脱液旋转蒸发浓缩,获得TFG浸膏.所得浸膏用双蒸水溶解,将溶解液依次经0.45和0.22 μm的滤膜过滤,最终获得TFG样液.根据亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法使样液显色,测定吸光度,计算样液中的TFG含量[6].
肝癌HepG2细胞由厦门大学细胞应激国家重点实验室提供,将其培养于含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM高糖培养基(完全培养基)中,添加双抗(青霉素100 U/mL,链霉素100 U/mL),培养箱控制温度37 ℃,CO2体积分数5%(下同).细胞汇合度达到70%~90%时传代,用0.25% trypsin-EDTA消化细胞1~2 min,1 800 r/min离心3 min,弃去trypsin-EDTA消化液,重悬细胞于DMEM完全培养基,传代比例为1:3.
收集指数生长期的细胞,以1×104个/孔接种于96孔板,设5个重复孔.贴壁过夜后,各组加TFG至终质量浓度分别为0,25,50,100,150,200,300和400 μg/mL,于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 和48 h.随后更换DMEM完全培养基,加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液,继续孵育4 h.再将液体全部吸出,每孔加入二甲基亚砜150 μL,摇床振荡10 min,于酶标仪发射波长490 nm下检测吸光度A,计算细胞存活率和抑制率.96孔板上无细胞而只有MTT反应试剂的孔为空白组,有HepG2细胞而未添加TFG的孔为对照组.计算细胞存活率和抑制率:
细胞存活率=(A实验-A空白)/(A对照-A空白)×100%;
抑制率=1-细胞存活率.
应用Origin 8.0软件进行MTT实验数据分析,获得拟合曲线和半抑制质量浓度(IC50).
消化收集细胞,以1×105个/孔接种于6孔板,贴壁过夜后,设置各实验组TFG终质量浓度为0,65,130和260 μg/mL,于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h,随后在倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察并拍照.
按照AO/EB染色试剂盒说明操作,消化收集指数生长期的细胞,以2×104个/mL接种于12孔板,每孔2 mL,于37 ℃、5%CO2培养箱中贴壁培养12 h.弃去旧培养基,加入含TFG(终质量浓度分别为65,130和260 μg/mL)的培养基2 mL,放回培养箱中孵育24 h.弃去含TFG的培养基,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3遍,加入1×buffer至覆盖细胞.每孔加入5 μL AO和5 μL EB,避光、室温孵育30 min,用荧光倒置显微镜观察细胞荧光.
将HepG2细胞以5×106 个/mL接种2 mL于6孔板.贴壁后用10 μL枪头在孔底笔直划痕,保持划痕宽度相同.PBS洗涤2遍,加入无血清的DMEM高糖培养基(无血清培养基),并立即在显微镜下拍摄划痕.用终质量浓度为0,65,130和260 μg/mL的TFG处理细胞,期间细胞用无血清培养基培养.48 h后在显微镜相同倍数下拍摄划痕,对比处理前后的划痕宽度,以此分析细胞迁移情况.
取处于指数生长期的HepG2细胞,以1×106个/mL接种2 mL于6孔板,培养箱中孵育过夜.各组分别用0,65,130和260 μg/mL的TFG作用于细胞24 h后各自收集培养体系内全部细胞,用PBS洗涤2次,1 200 r/min离心5 min,弃去PBS.用-20 ℃预冷的70%乙醇重悬,于4 ℃静置1 h.1 200 r/min离心5 min,收集沉淀,用PBS洗涤2次,并用500 μL PBS重悬.加入5 μL 10 mg/mL PI染液和2.5 μL 20 mg/mL RNase A,避光、室温孵育30 min.300目尼龙筛过滤细胞,进样于流式细胞仪检测细胞周期.
按照Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒说明操作.各组分别用0,65,130和260 μg/mL的TFG作用于细胞24 h后消化,1 800 r/min离心5 min,收集全部细胞,用PBS洗涤1次,然后用195 μL 1×结合液重悬细胞,使细胞密度在2×105~5×105 个/mL范围,加入5 μL Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC),避光、室温孵育15 min,用200 μL 1×结合液洗涤1次,1 000 r/min离心5 min,弃上清,用190 μL 1×结合液重悬细胞,加入10 μL 10 mg/mL PI,避光、室温孵育15 min后用流式细胞仪检测.
按照细胞ROS检测试剂盒说明操作.指数生长期的细胞于培养箱中孵育12 h使其完全贴壁,用0,65,130和260 μg/mL的TFG作用于细胞24 h后,用PBS洗涤2次,收集细胞.按1:1 000稀释添加2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)至无血清培养基.重悬细胞于DCFH-DA稀释液中,37 ℃孵育20 min,适时振荡混匀.用无血清培养基洗涤细胞3次,并用PBS重悬,再用300目尼龙网过滤细胞,进样于流式细胞仪检测,激发波长488 nm,发射波长525 nm.
用0,65和130 μg/mL的TFG分别处理各组细胞24 h,收集合并悬浮和贴壁细胞,然后用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞并提取总蛋白,用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度.
蛋白质免疫印迹:十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,聚偏氟乙烯膜转膜2 h.封闭液(质量分数5%的脱脂奶粉)浸泡15 min进行封闭; 分别加入β-actin、Bax、Bcl-2一抗4 ℃孵育过夜; 然后加入HRP标记的二抗室温孵育1 h.按HRP-ECL试剂盒说明操作显影.
使用统计软件SPSS 21.0进行数据统计分析,结果用平均值±标准差表示,独立样本采用t-检验,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),p<0.05表示差异显著.
如图1(A)所示,TFG对肝癌HepG2细胞的体外增殖有明显的抑制作用,与对照组相比,100 μg/mL及以上质量浓度的TFG处理24 h后,50 μg/mL及以上质量浓度的TFG处理48 h后,HepG2细胞存活率呈现出显著差异(p<0.05),可见抑制作用有浓度和时间依赖效应.分别以24和48 h的抑制率对TFG质量浓度绘制指数拟合曲线,可得TFG对人肝癌细胞HepG2作用24 h的IC50为190.80 μg/mL(图1(B)),作用48 h的IC50为125.96 μg/mL(图1(C)).
如图2所示:随着TFG质量浓度的增大,HepG2细胞形态皱缩,边缘粗糙,呈不规则状,胞体折光度减小,内含物减少; 260 μg/mL TFG处理的HepG2细胞出现凋亡小体.
(A)细胞存活率,*表示实验组与对照组有显著差异(p<0.05);(B)24 h和(C)48 h的抑制率指数拟合曲线.
如图3所示:对照组中细胞核排列比实验组紧密,核染色质分布均匀,发出淡绿色荧光; 65 μg/mL TFG实验组中细胞排列疏松,发出淡绿色荧光,与对照组差异不明显; 130 μg/mL TFG实验组中细胞数量减少,个别细胞出现发明亮绿色和橙红色荧光的细胞核,表明部分细胞的细胞膜受损; 260 μg/mL TFG实验组中细胞数量明显减少,大量细胞发生染色质凝集和细胞膜破损,细胞核发出明亮绿色和橙红色荧光.
图2 相差显微镜观察HepG2细胞经TFG处理24 h后细胞形态的变化
Fig.2 Observation on morphological changes of HepG2 cells treated with TFG for 24 h by phase contrast microscope
如图4所示:划痕处理48 h后,对照组与65 μg/mL TFG实验组的划痕宽度明显变窄; 而130和260 μg/mL TFG实验组的划痕宽度变化不大.为了较准确地量化TFG对肝癌HepG2细胞迁移能力的影响,测定0和48 h的两划痕宽度,差值即为细胞迁移的距离,进而求得细胞迁移率.结果显示(图5):当TFG处理肝癌HepG2细胞后,3个实验组的细胞迁移率与对照组相比均有显著差异(p<0.05).
不同字母表示存在显著性差异(p<0.05),下同.
如图6所示:处理24 h后,各实验组与对照组相比,S期的细胞百分比显著增多(p<0.05),由对照组的(38.03±0.86)%增加到260 μg/mL TFG实验组的(42.79±0.83)%; 同时,G2/M期的细胞百分比显著减少(p<0.05),由对照组的(18.38±0.67)%减少到260 μg/mL TFG实验组的(13.79±0.58)%.该结果表明TGF可影响肝癌HepG2细胞周期分布,使细胞周期阻滞于S期.
如图7所示:处理24 h后,随着TFG质量浓度的增加,细胞的FITC荧光呈现阳性偏移,表明凋亡细胞比例增加; 对照组的细胞凋亡率为(0.26±0.03)%,65,130和260 μg/mL TFG实验组的凋亡率分别为(0.55±0.05)%,(47.00±1.31)%和(76.39±1.39)%,其中130和260 μg/mL TFG实验组与对照组相比具有显著性差异(p<0.05).
如图8所示:处理24 h后,各实验组细胞内ROS水平与对照组相比均存在显著性差异(p<0.05); 当TGF质量浓度达到260 μg/mL时,细胞内ROS水平下降为对照组的6.9%(p <0.05).
在细胞凋亡过程中的Bcl-2蛋白家族起着重要的调节作用,Bax是促凋亡蛋白,Bcl-2是凋亡抑制蛋白.提取对照组与65,130 μg/mL TFG实验组的细胞总蛋白进行蛋白质免疫印迹检测,结果发现Bax的表达略微增加,Bcl-2的表达量明显降低(图9).
图6 HepG2细胞经TFG处理24 h后细胞周期分布的变化
Fig.6 Variation of cell cycles of HepG2 cells treated with TFG for 24 h
图7 HepG2细胞经TFG处理24 h后凋亡率的变化
Fig.7 Variation of apoptosis rates of HepG2 cells treated with TFG for 24 h
图8 HepG2细胞经TFG处理24 h后细胞内ROS水平的变化
Fig.8 Variation of ROS levels in HepG2 cells treated with TFG for 24 h
自然来源的营养素能有效消除癌症细胞[11],探索天然、高效和低毒的天然药物进行长期的辅助抗癌具有重要意义[12].白凤菜具有多种药理作用,含有丰富有治疗作用的黄酮,适合患者长期食用.有研究证实,高浓度白凤菜水提口服液可阻止小鼠胃肠在机体糖负荷情况下对葡萄糖的吸收[13]; 白凤菜叶提取物能在一定程度上提高抗氧化酶活性和抑制促炎性因子表达,抑制大鼠的炎症[14]; 白凤菜醇提取物对斑马鱼慢性酒精性脂肪肝具有防治作用,能够有效减轻肝脏的炎性病理[15]; 白凤菜醇提取物还可治疗大鼠非酒精性脂肪肝,明显降低非酒精性脂肪肝模型大鼠血脂(甘油三酯和总胆固醇)、丙氨酸氨基转移酶及天冬氨酸氨基转移酶的水平[16]; 白凤菜的乙酸乙酯提取物通过自噬作用抑制HeLa细胞的增殖,而非通过细胞凋亡途径抑制癌细胞增殖[17].本研究通过MTT实验、细胞形态显微镜观察、划痕实验和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术,发现TFG对肝癌HepG2细胞具有抑制增殖和迁移及促进凋亡的作用.
各类细胞在生命周期中不断产生和清除细胞内新陈代谢产物ROS,不同细胞中ROS的表达水平也不同.肿瘤细胞中高水平的ROS有助于激活原癌基因,有利于维持细胞生长和增殖,导致DNA损伤和遗传不稳定性; 同时,肿瘤细胞会提高抗氧化蛋白的表达来消除高ROS的影响,建立氧化还原平衡,维持原癌基因信号通路,防止细胞凋亡[18].有研究证实通过化学或生物学的抗氧化剂降低肿瘤细胞的ROS水平,重新构建细胞内还原系统,可抑制肿瘤细胞的增殖[11,18-19].本研究结果显示当肝癌HepG2细胞被TFG作用后,细胞内ROS水平显著降低(p<0.05),细胞内氧化还原状态改变,可能使细胞在低ROS水平下的相关信号传导途径发生改变,从而抑制肝癌HepG2细胞的生长,并进一步引起细胞凋亡.
Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的重要蛋白,与凋亡关系最密切.促凋亡蛋白Bax位于细胞线粒体膜上,寡聚化形成一个跨膜通道,从而增加膜通透性,导致膜电位降低[20].位于内质网膜上的Bcl-2可能通过阻断Ca2+从内质网向胞质的流动,与Bax结合形成异源二聚体,阻止细胞凋亡[21].本研究中65和130 μg/mL TFG实验组Bax的表达量略微增加,Bcl-2的表达量明显降低,而当Bax较Bcl-2相对增高时则可能形成大量的Bax-Bax同源二聚体,两种凋亡调控蛋白间的平衡被打破,进而促使细胞凋亡[22-24].
本研究显示不同剂量的TFG作用于肝癌HepG2细胞24和48 h后,当质量浓度小于50 μg/mL时,延长给药时间,细胞存活率无显著性差异; 而当质量浓度大于100 μg/mL时,延长给药时间,细胞存活率有显著性差异,随TFG质量浓度的增加而下降,细胞皱缩,染色质凝集,细胞迁移能力下降,细胞周期被阻滞在S期,荧光凋亡探针呈现阳性,细胞内ROS水平显著降低,凋亡相关蛋白Bax表达量略微上升,Bcl-2表达量明显要下降.综上可见,一定剂量的TFG可抑制细胞活性并诱导细胞凋亡,为进一步研究和开发TFG作为抗肝癌的天然药物提供了理论基础.