基金项目:国家微生物资源平台项目(NIMR-2019-9); 厦门市海洋经济创新发展示范项目(16PZP001SF16); 国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室开放研究基金(HY201505)
通信作者:wzs@xmu.edu.cn(王兆守); shaozz@163.com(邵宗泽)
(1.厦门大学化学化工学院,福建 厦门 361005; 2.自然资源部第三海洋研究所,自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室,福建 厦门 361005)
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China; 2.Key Laboratory of Marine Biological Genetic Resources,Ministry of Natural Resources,The Third Institute of Oceanography,Ministry of Natural Resources of China,Xiamen
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201904012
功能化石墨烯因其优异的导电、传热和机械性能,应用前景广阔.为了解功能化石墨烯对海洋环境可能的生态毒性效应,其分别加入近岸海水(终质量浓度50 mg/L)和沉积物(终质量分数50 mg/kg)中,模拟海洋环境对样品培养2周,并采用DNA高通量测序技术分析功能化石墨烯对海洋细菌群落结构的影响.结果表明功能化石墨烯对两种海洋环境来源的细菌物种组成均有明显影响,但效果不同:暴露于功能化石墨烯后,海水中细菌的物种多样性和丰度降低,而沉积物中细菌的物种多样性和丰度升高,这可能是功能化石墨烯在海水和海洋沉积物中分散、吸附和团聚等环境行为存在差异所致.然而,在两种海洋环境来源的处理组中,功能化石墨烯的存在均对光合细菌(蓝细菌门)的生长起促进作用.上述结果可为功能化石墨烯的海洋生态安全性评估提供参考.
Functionalized graphene has broad application due to its excellent electrical conductivity,heat transfer and mechanical properties.In order to explore the possible ecotoxic effects of functionalized graphene on marine environments,we added functionalized graphene into coastal seawater(50 mg/L)and sediments(50 mg/kg)respectively,and cultured the samples for 2 weeks under conditions that simulated the marine environments.The effect of functionalized graphene on the structure of marine bacterial community was analyzed by high-throughput DNA sequencing technology.The results showed that functionalized graphene had significant but different effects on the species composition of bacteria from two different marine environments.Upon exposure to functionalized graphene,species diversity and abundance of bacteria in seawater reduced,while species diversity and abundance of bacteria in sediments increased.This may be due to the differences in the environmental behaviors such as dispersion,adsorption and aggregation of functionalized graphene in seawater and marine sediments.However,functionalized graphene promoted the growth of photosynthetic bacteria(Cyanobacteria)in both seawater and marine sediments.This study provides a reference for the assessment of marine ecological safety of functionalized graphene.
石墨烯是由sp2杂化碳原子组成的二维蜂窝状晶体,只有一层原子,是目前世界上已知最薄、最坚硬的材料[1].石墨烯凭借其优异的机械、导电和传热性能,在化学、物理、生物医学和材料科学等领域掀起了研究热潮,同时其生态毒性效应也引起了人们的广泛关注[2].Perreault等[3]将大肠杆菌(Escherichia coli)暴露于不同尺寸的石墨烯中,发现石墨烯的抗菌性能随着尺寸减小而增强,推断这主要是因为小片径石墨烯具有明显的表面缺陷,而这些表面缺陷是其抗菌机制的关键.Ren等[4]基于实时荧光定量PCR和焦磷酸测序评估了石墨烯对土壤中细菌的群落结构、丰度和功能的影响,发现石墨烯可在短期内增加土壤中酶的活性和菌体生物量,且参与氮循环和有机物降解的一些细菌群落受石墨烯影响较大.
纯石墨烯纳米片之间存在很强的分子间作用力,在水相中极易形成团聚体.为充分发挥石墨烯的各项优异性能,提高其在水相中的分散性和可塑性,人们通常会对石墨烯进行表面功能化[5].随着功能化石墨烯在生物医药、航空航天和储能材料等诸多领域被广泛地应用,其将不可避免地在生态环境中富集,而可能的汇集地之一便是海洋环境.在水环境中,石墨烯基材料可表现出分散效应、团聚效应和吸附效应,这主要受其所处环境的光照强度、离子浓度、离子种类和pH值等因素影响[6].此外,石墨烯基材料自身的一些性质,如浓度、层数和表面结构缺陷等,也会影响其在水环境中的分散性和稳定性[7-8].上述因素的综合作用决定了石墨烯基材料的环境行为.功能化石墨烯在水环境中几乎不能降解,因此即使目前其暴露于海洋环境后的浓度较低,也应引起人们足够的关注[9].
海洋是地球上最大的生态系统,拥有极为丰富的矿产、水产和微生物资源.海洋生态系统中的微生物既有分解者也有生产者,它们对海洋生态系统的良性循环发挥着重要作用[10].当石墨烯基材料暴露于海洋环境后,其对海洋微生物群落结构的影响目前尚未知.本研究在实验室条件下模拟海洋生态环境,并采用DNA高通量测序技术分析海水和海洋沉积物中细菌群落结构对功能化石墨烯的响应,以期为功能化石墨烯的海洋生态毒性效应做出早期预警.
取0.253 g氧化石墨烯(购自中国科学院成都有机化学有限公司)放入装有蒸馏水的烧杯(50 mL)中,将烧杯放入超声振荡器中超声处理(100 W,5 min,下同); 然后快速加入25.019 g聚乙二醇(PEG,相对分子质量300~600),在25 ℃下300 r/min摇床中搅拌24 h,得到粗功能化石墨烯; 最后用乙醇冲洗7次以洗去未反应的PEG,放入真空干燥室80 ℃下干燥4 h,则制备得到纯功能化石墨烯[11].
称取适量功能化石墨烯固体粉末并加入一定量去离子水,经高温灭菌(121 ℃,20 min)和超声处理后配制得1 mg/L母液.吸取适量滴加到干净的硅片上,烘干后分别通过Quanta 450扫描电子显微镜(SEM)和JEM-1230透射电子显微镜(TEM)进行表征.
在514.5 nm波长条件下,通过RM-1000拉曼光谱仪检测功能化石墨烯和氧化石墨烯的拉曼光谱,其峰值位置分辨率小于1 cm-1.光谱测定范围为800~2 000 cm-1.
设置折射率为1.333,吸收率为0.01,通过Zetaszier Nano-ZS90纳米粒度及电位分析仪检测氧化石墨烯和功能化石墨烯的zeta电位.纳米材料在体系中的分散性越好,则其zeta电位的绝对值越大.
分别在厦门市白城(24°26' N,118°05' E)、杏林湾(24°35' N,118°03' E)和五缘湾(24°32' N,118°10' E)三地取海水样品混合并装入锥形瓶中(每瓶1 L).对照组的海水样品在光照强度1 200 lx条件下震荡(转速为60 r/min)培养,不添加功能化石墨烯; 处理组添加适量经超声处理的功能化石墨烯,使其质量浓度达到50 mg/L,其他条件与对照组相同.2周后,使用0.22 μm 滤膜将海水样品逐一抽滤,并用土壤DNA提取试剂盒(PowerSoil DNA isolation kit,上海赛百盛基因技术有限公司)提取海水样品的DNA.通过NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)检测核酸浓度,保证样品DNA的质量浓度超过50 ng/μL.最后,将海水样品的DNA送往上海美吉生物医药科技有限公司进行基于16S rRNA基因的高通量测序(引物对为338F/806R,338F序列为5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3',806R序列为5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3').每组样品均设3个生物学重复.
分别在厦门市白城、杏林湾和五缘湾三地取海洋沉积物样品混合并装入培养箱中(每箱5 kg).对照组沉积物样品在光照强度1 200 lx条件下培养,每天搅拌6次(上、下午各3次),处理组添加适量经超声处理的功能化石墨烯,使其质量分数达到50 mg/kg,其他条件与对照组相同.2周后,从培养箱中随机取0.75 g 混合均匀的海洋沉积物样品,提取DNA、检测核酸浓度并送样测序(同1.2节).每组样品均设3个生物学重复.
Alpha多样性分析包括Sobs指数、Chao指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数5项度量标准,以此衡量单个样品中的物种多样性水平,其中,前4个指数越大,Simpson指数越小,表示样品中物种越丰富[12].Coverage指数代表样品文库的覆盖率,该指数越高,则样本中序列未被测出的概率越低[13],以此反映测序结果的可信度.
稀释曲线是从样本中随机抽取序列,统计这些序列所代表的操作分类单元(OTU),并以抽取的序列数目为横坐标,相应的OTU数目为纵坐标,绘制曲线.当曲线趋向平坦时,说明测序数据量合理,更多的数据量只会产生少量新的物种,反之则表明继续测序还可能产生较多新的物种[12].对于不同的样本来说,稀释曲线位于上方的样本的物种丰富度高于位于下方的样本.
取培养2周后的海水样品1 mL并将其稀释105倍; 取培养2周后的沉积物样品10 g加入装有90 mL 去离子水的锥形瓶中,将该悬浊液充分摇匀后取1 mL悬浊液并将其稀释105倍.取100 μL稀释后的样品均匀涂布于2216E平板(Oxoid Limited公司); 在37 ℃下连续培养48 h后,计数菌落并与对照组平板上的菌落进行比较.
采用菌落计数法[14]检测经功能化石墨烯处理后样品中的细菌浓度,并计算存活率(S):S=At/Ac×100%,其中At和Ac分别表示处理组和对照组平板上的细菌浓度.每组样品均设3个生物学重复.
在“门”和“属”的分类水平上对海洋细菌的物种进行统计分析,重点研究海水和海洋沉积物中细菌的物种组成及相对丰度在功能化石墨烯影响下的演替规律[15].
图1(a)和(b)分别为功能化石墨烯的SEM和TEM形貌表征结果,可以看出:功能化石墨烯整体呈片层结构,粒径为3~5 μm,表面有很多不规则凸起和褶皱,且边缘处极其尖锐.图1(c)为氧化石墨烯和功能化石墨烯的拉曼光谱表征结果,可以看出:氧化石墨烯的G峰和D峰分别出现在1 597和1 345 cm-1,而功能化石墨烯的G峰和D峰分别出现在1 588和1 341 cm-1.由于氧化石墨烯表面分布着大量孤立的C=C双键,其G峰呈现向更高强度的位移,通常定义为蓝移[16].图1(d)为氧化石墨烯和功能化石墨烯的zeta电位表征结果:氧化石墨烯的zeta电位为-31.87 mV,而功能化石墨烯的zeta电位为-38.30 mV.上述结果说明功能化石墨烯比氧化石墨烯拥有更良好的分散性.
海水中细菌的Alpha多样性指数分析结果如表1所示:处理组的Sobs指数、Chao指数、Ace指数和Shannon指数较对照组有所降低,而Simpson指数较对照组有所升高; 对照组和处理组中Coverage指数均超过99.9%.如图2(a)所示,对高通量测序的样本序列随机抽样所得稀释曲线趋于平坦,且对照组的OTU数目大于处理组.上述结果表明功能化石墨烯能降低海水中细菌的物种丰度和多样性.
海洋沉积物中细菌的Alpha多样性指数分析结果如表1所示:处理组的Sobs指数、Chao指数、Ace指数和Shannon指数较对照组有所上升; 而Simpson指数较对照组有所下降; 对照组和处理组中Coverage指数均超过99.8%.如图2(b)所示,对高通量测序的样本序列随机抽样所得稀释曲线趋于平坦,且处理组的OTU数目大于对照组.上述结果表明功能化石墨烯能提高海洋沉积物中细菌的物种丰度和多样性.
表1 功能化石墨烯对海洋细菌Alpha多样性指数的影响
Tab.1 Effects of functionalized graphene on Alpha diversity indexes of marine bacteria
图3 功能化石墨烯对海水和海洋沉积物样品中细菌浓度的影响
Fig.3 Effects of functionalized graphene on concentration of bacteria in seawater and marine sediments
如图3所示:对照组海水样品中细菌浓度为4.27×107 cfu/mL(cfu为菌落形成单位,下同),而处理组海水样品中细菌浓度为3.25×107 cfu/mL,海水样品经功能化石墨烯处理后细菌的存活率为76.1%; 对照组沉积物样品中细菌浓度为1.56×108 cfu/mL,而处理组沉积物样品中细菌浓度高达1.90×108 cfu/mL,沉积物样品中细菌经功能化石墨烯处理后的存活率为121.8%.可见,功能化石墨烯对海水中细菌的生长具有一定的抑制作用,而对海洋沉积物中细菌的生长具有一定的促进作用.
物种组成的影响
在“门”水平上对海水中细菌物种组成的分析结果显示,海水样品中共有25个门的细菌被检出,且对照组和处理组的菌群多样性存在差异.如表2所示:对照组海水样品中的优势菌群为变形菌门,其相对丰度为70.70%,其次为拟杆菌门、蓝细菌门等; 处理组海水样品中的优势菌群仍为变形菌门,但其相对丰度下降至58.39%,且蓝细菌门和疣微菌门的相对丰度较对照组明显提高.此外,在对照组中衣原体门(Chlamydiae)和螺旋体门(Spirochaetae)被检出,而在处理组中未被检出; 纤维杆菌门(Fibrobacteres)在对照组中未被检出,而在处理组中被检出.
海洋沉积物样品中共有22个门的细菌被检出,且对照组和处理组的菌群多样性存在差异.如表2所示:对照组沉积物样品中相对丰度排在前两位的是变形菌门和拟杆菌门,两者总占比超过90%; 处理组沉积物样品中相对丰度排在前两位的仍为变形菌门和拟杆菌门,但两者相对丰度较对照组均有所下降,且蓝细菌门、浮霉菌门和放线菌门的相对丰度较对照组均大幅提高.此外,Gracilibacteria和Saccharibacteria在对照组中被检出,但在处理组中未被检出.
在“属”水平上对海水细菌物种组成的分析结果显示,海水样品中共有285个属的细菌被检出,且对照组和处理组的菌群多样性存在差异.如表3所示:处理组中norank_c_Cyanobacteria、unclassified_f_Halieaceae和unclassified_f_Rhodobacteraceae的相对丰度较对照组大幅提高; norank_f_Piscirickettsiaceae在对照组中的相对丰度为14.18%,而在处理组中的相对丰度较低
表2 “门”水平上的海水和海洋沉积物中细菌的物种组成分析
Tab.2 Analysis of species composition of bacteria in seawater and marine sediments on phylum level
(仅为0.60%).除上述4个属外,对照组和处理组的其他菌属相对丰度差异较小.
海洋沉积物样品中共有316个属的细菌被检出,且对照组和处理组的菌群多样性存在差异.如表3所示:norank_c_Cyanobacteria在对照组中的相对丰度较低(仅为0.88%),而在处理组的相对丰度则大幅升高至11.34%; 处理组中Lentibacter、Planktomarina、norank_f_Cryomorphaceae和Pseudoalteromonas的相对丰度均较对照组大幅降低.除上述5个属外,对照组和处理组的其他菌属相对丰度差异较小.
本研究通过实验室模拟功能化石墨烯污染海洋环境,分析了海水和海洋沉积物中细菌群落对功能化
表3 “属”水平上的海水和海洋沉积物中细菌的物种组成分析
Tab.3 Analysis of species composition of bacteria in seawater and marine sediments on genus level
石墨烯的响应,以及功能化石墨烯对海水和海洋沉积物中细菌生长的影响.在本课题组前期实验中,通过检测不同质量浓度(0~50 mg/L)的功能化石墨烯对海杆菌(Marinobacter sp.)、盐单胞菌(Halomonas sp.)、交替单胞菌(Alteromonas sp.)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、聚球藻(Synechococcus sp.)和红酵母(Rhodotorula sp.)等海洋微生物生长的影响,发现50 mg/L功能化石墨烯对上述海洋微生物的抑菌性能最强,生长抑制率为20%~50%(未发表).因此本研究中海水和海洋沉积物处理组分别添加50 mg/L和50 mg/kg功能化石墨烯; 但考虑到沉积物密度高于海水,沉积物中功能化石墨烯的实际浓度应该高于海水.
Alpha多样性分析和稀释曲线分析结果显示,经功能化石墨烯处理后,海水中细菌的多样性和物种丰度下降,而海洋沉积物中细菌的多样性和物种丰度上升; 同时,菌落计数结果显示,功能化石墨烯能够从整体上抑制海水中细菌的生长,而促进海洋沉积物中细菌的生长.Zou等[17]提出石墨烯能与微生物表面直接接触并对其造成不可逆的机械损伤,从而抑制微生物正常的生长和代谢活动.Farid等[18]通过激光诱导击穿光谱测定经石墨烯处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞膜的完整性,发现石墨烯主要通过直接破坏细菌的细胞膜而造成菌体损伤.另有研究报道,由于石墨烯比表面积较大且拥有良好的共轭结构,能够吸附有机物,从而可为微生物生长提供营养丰富的附着基底[19-20].基于上述研究结果推测:在海水中功能化石墨烯分散性好,能够与细菌直接接触,容易对其造成机械损伤,从而使得海水样品中细菌的多样性、物种丰度和浓度下降; 而在海洋沉积物样品中,功能化石墨烯可能与沉积物中的大量颗粒物相互作用从而减弱其细胞毒性,也可能通过吸附沉积物中的大量颗粒有机物为细菌的生长与生物膜的形成提供适宜“载体”,从而使得海洋沉积物样品中细菌的多样性、物种丰度和浓度上升,但具体机制还有待深入研究.
在功能化石墨烯处理的海水样品中,“门”水平上蓝细菌门和疣微菌门的相对丰度提高,变形菌门和拟杆菌门的相对丰度降低; “属”水平上主要变化的类群属于以上门类中未在平板上实现纯培养的类群,其中norank_c_Cyanobacteria、unclassified_f_Halieaceae和unclassified_f_Rhodobacteraceae的相对丰度升高,而norank_f_Piscirickettsiaceae的相对丰度降低.在功能化石墨烯处理的海洋沉积物样品中,“门”水平上蓝细菌门、浮霉菌门和放线菌门的相对丰度升高,变形菌门和拟杆菌门的相对丰度降低; 在“属”水平上,norank_c_Cyanobacteria的相对丰度升高,而Lentibacter、Planktomarina、norank_f_Cryomorphaceae和Pseudoalteromonas的相对丰度降低.由以上分析可见,无论海水样品还是沉积物样品,添加功能化石墨烯后光合细菌(蓝细菌门)的相对丰度均有所上升,其影响机制有待进一步研究.本课题组前期研究表明低质量浓度(0.1 mg/L)的纳米二氧化钛可以促进光合细菌聚球藻(Synechococcus sp.)生长[21].由此推测无论是功能化石墨烯还是纳米二氧化钛,其优异的光学和电学性能可能是促进光合细菌生长的关键.
综上,本研究通过分析海洋细菌群落结构在功能化石墨烯影响下的变化,发现海水和海洋沉积物中细菌对功能化石墨烯的响应存在差异.功能化石墨烯降低了海水中细菌的多样性和丰度,而提高了海洋沉积物中细菌的多样性和丰度; 同时,功能化石墨烯对不同海洋细菌的影响虽有所不同,但在海水和海洋沉积物中均可促进光合细菌(蓝细菌门)生长.这些结果为进一步评估石墨烯基材料的海洋生态安全性提供了一定参考.