收稿日期:2019-02-16录用日期:2019-04-14
基金项目:国家自然科学基金(U1805233,31172438); 海洋生物制备技术国家地方联合工程实验室(厦门大学)开放课题基金(201807)
通信作者:wshuang@jmu.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金(U1805233,31172438); 海洋生物制备技术国家地方联合工程实验室(厦门大学)开放课题基金(201807)
通信作者:wshuang@jmu.edu.cn
拟穴青蟹两个Crustin新变体的克隆与表达分析
(1.集美大学水产学院,福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心,福建 厦门 361021; 2.海洋生物制备技术国家 地方联合工程实验室,福建 厦门 361102; 3.农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建 厦门 361021)
Cloning and expression analysis of two novel Crustin isoforms from Scylla Paramamosain
ZHANG Cailiang1,HUANG Bei1,XIONG Jing1,CHEN Fangyi2,HUANG Wenshu1,2,3*
(1.College of Fisheries,Fujian Collaborative Innovation Center forExploitation and Utilization of Marine Biological Resources, Jimei University,Xiamen 361021,China; 2.State-Province Joint Engineering Laboratory of Marine Bioproducts and Technology,Xiamen
antimicrobial peptides; Crustin; gene cloning; genomes; expression analysis; Scylla paramamosain
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201902012
备注
摘要
全文
图/表
参考文献
附录
Crustins是一类广泛存在于甲壳动物中富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽.该研究从拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中克隆获得两个Crustin新变体,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b.分析显示两者的前体肽包含N-端信号肽和C-端成熟肽两部分,成熟肽均含有12个位置高度保守的半胱氨酸.SpCrus1b在信号肽和乳清酸蛋白(WAP)结构域之间存在一个半胱氨酸富集区,属于典型的Ⅰ型Crustins; SpCrus2b除具有SpCrus1b的结构特征外,在近N-端额外含有一个甘氨酸富集区,属于典型的Ⅱ型Crustins.基因组结构分析显示SpCrus1b的基因组DNA序列为4个外显子/3个内含子结构,而SpCrus2b的基因组DNA序列为2个外显子/1个内含子结构.两者均主要在鳃中表达,且在脂多糖(LPS)刺激24 h和聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激12 h后表达量均极显著上调(p<0.01),表明SpCrus1b和SpCrus2b参与了拟穴青蟹抗细菌和抗病毒的先天免疫过程.
Crustins,widely exist in crustaceans,are cationic cysteine-rich antimicrobial peptides(AMPs).In this study,two novel Crustin isoforms were identified from Scylla paramamosain,namelySpCrus1b and SpCrus2b.The analysis showed a signal peptide at the N-terminus and a mature peptide at the C-terminus in both propeptides,and there were 12 cysteine residues at highly conserved positions found in mature peptides.In SpCrus1b,there was a cysteine-rich region(CRR)between the signal peptide and whey acidic protein(WAP)domain,showing a typical character of type ⅠCrustins.Compared with SpCrus1b,SpCrus2b possessed an extra glycine-rich region(GRR)at the N-terminus,which was proposed as type Ⅱ Crustins.In addition,the genomic organization analysis revealed that SpCrus1b had 4 exons/3 introns, while SpCrus2b had 2 exons/1 intron.Both SpCrus1b and SpCrus2b were highly expressed in gills and could be significantly up-regulated(p<0.01)after 24 h lipopolysaccharide(LPS)challenge or 12 h polyinosinic-polycytidylic acid(PolyI:C)challenge. The results suggested that SpCrus1b and SpCrus2b were potential AMPs,which played an important role in the innate immune process of S. paramamosain against bacterial and viral infections.
引言
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)又称宿主防御肽,是机体先天免疫系统的重要组成部分.它不仅可以抑制或杀灭多种病原体,也可以激发机体的其他抗病免疫相关反应[1].目前,全球已经建立了多个抗菌肽数据库,其中APD(the Antimicrobial Peptide Database,http:∥aps.unmc.edu/AP/main.php)是最具影响力的数据库之一.截止到2019年1月1日,该数据库共收集抗菌肽3 048种,其中源自甲壳动物的约60种,主要包括Crustins[2]、Penaeidins[3]、ALFs(anti-lipopolysa-ccharide factors)[4]、Lysozymes[5]和Histones[6]等.
Crustins是甲壳动物中研究较早、种类较多的一类抗菌肽[7].首个Crustin是在1999年由Relf等[8]从普通滨蟹(Carcinus maenas)的血淋巴细胞中分离得到,它是一个富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,分子质量为11.5 ku,可抑制革兰氏阳性细菌的生长.随后,越来越多Crustin-like抗菌肽在虾类和蟹类中相继被报道,并将其归为Crustins抗菌肽家族.该家族有着典型的结构特征,即N-端信号肽、多域区和C-端乳清酸蛋白(whey acidic protein,WAP)结构域[9].根据成熟肽的氨基酸组成和WAP结构域的数量不同,Crustins家族可分为5种类型[10]:Ⅰ型,多域区为1个半胱氨酸富集区(cysteine-rich region,CRR); Ⅱ型,除含有1个CRR外,还有1个甘氨酸富集区(glycine-rich region,GRR); Ⅲ型,多域区为1个脯氨酸-精氨酸富集区(proline/arginine-rich region); Ⅴ型,多域区含有1个CRR和1个芳香族氨基酸富集区; 与上述四者不同,Ⅳ型无多域区,且含有2个WAP结构域.
Crustins种类繁多,目前在GenBank的蛋白数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)中已有超过140条Crustins同源序列.序列分析发现同一物种存在不同类型的Crustins,且同型Crustins往往拥有多个变体.目前,拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中已报道的7条Crustins分别属于Ⅰ型和Ⅱ型.已有研究表明大多数Crustins在血淋巴细胞中高表达[8,11-14],在其他组织/器官,如心脏、肝胰腺、鳃、肠、神经、肌肉、眼柄、上皮等有时也能检测到其转录本.Crustins的不同类型甚至同型的不同变体对病原刺激后的响应情况也不尽相同,例如在拟穴青蟹中已报道的几条Crustins均在鳃中高表达,但经细菌或者病毒刺激后却表现出不同的表达模式[15-18].基于此,本研究通过分析拟穴青蟹转录组数据发现了2条新的Crustin基因序列,对其全长基因序列进行克隆和验证后分析了两者的基因组DNA序列结构、蛋白质结构和系统进化关系,在正常组织/器官以及受到病原刺激后的转录表达情况,以期进一步丰富蟹类Crustin基因的基础数据.
1 材料与方法
1.1 拟穴青蟹取样及预处理拟穴青蟹购自福建省厦门市某水产品市场,个体质量(300±10)g,壳长(12.0±0.5)cm.在暂养池(3.45 m×1.25 m)暂养2周.
采样前,将拟穴青蟹置于冰上麻醉5 min,并做好样品记录(如体质量、壳长等信息).体表消毒后,选用规格为5 mL的一次性注射器抽取预冷后的蟹血淋巴抗凝剂(NaCl 450 mmol/L、葡萄糖 100 mmol/L、柠檬酸26 mmol/L、柠檬酸三钠30 mmol/L、乙二胺四乙酸(EDTA)10 mmol/L,pH 4.6,经0.22 μm滤膜过滤除菌),于第四步足基部插入,小心吸取血淋巴,轻轻颠倒与抗凝剂充分混匀后快速转移至预冷后的50 mL 离心管; 然后将血淋巴样品置于4 ℃、800 g下离心15 min,收集沉淀,加入1 mL Trizol试剂(购自Invitrogen公司)重悬沉淀,置于液氮中保存备用.
将采血后的拟穴青蟹放于无菌瓷盘中,小心剖开甲壳使各组织/器官充分显露,迅速采集心脏、肝胰腺、肠、鳃、卵巢、上皮6个组织/器官样品,并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,然后加入1 mL Trizol试剂匀浆后置于液氮中保存备用.
1.2 靶基因克隆参考Trizol试剂说明书提取样品总RNA,经分光光度计(NanoDrop 2000)检测其质量浓度(约1 500 ng/μL)和纯度(A260/A280比值范围为1.8～2.0),1.2%(质量分数,下同)琼脂糖凝胶电泳检测其完整性; 检测合格后用DNase Ⅰ(购自NEB公司)酶解可能残余的基因组DNA; 将处理后的RNA样品采用GoScriptTM 反转录试剂盒(购自Promega公司)进行反转录,具体方法参照试剂盒说明书.
以拟穴青蟹鳃组织cDNA为模板,进行PCR反应:上下游引物(SpCrus1b-F/R、SpCrus2b-F/R,见表1)各0.50 μL,2×EasyTaq PCR SuperMix(购自北京全式金生物技术有限公司)12.75 μL,cDNA模板1.00 μL,无菌水补充至25.00 μL.PCR反应条件:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s,56 ℃(SpCrus1b)/64 ℃(SpCrus2b)30 s,72 ℃ 45 s,35个循环; 72 ℃ 10 min.
PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,切取预期大小的电泳条带,用E.Z.N.AD2500-02凝胶回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收靶基因片段,再与pMD19-T载体(购自TaKaRa公司)连接并转化到DH5α感受态细胞中,经阳性克隆鉴定(引物M13-F/R,见表1)后测序验证.
表1 本研究所用引物
Tab.1 Primers used in this study1.3 靶基因基因组DNA序列克隆取拟穴青蟹肌肉组织约100 mg,经苯酚/三氯甲烷/异戊醇抽提法获得基因组DNA,并以此为模板进行PCR反应:上下游引物(同1.2节,见表1)各0.50 μL,LA Taq酶(购自宝生物有限公司)0.25 μL,10×LA Taq Buffer 2.50 μL,dNTP Mix 4.00 μL,基因组DNA模板1.00 μL,无菌水补充至25.00 μL.PCR反应条件:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s,56 ℃(SpCrus1b)/64 ℃(SpCrus2b)30 s,72 ℃ 90 s,35个循环; 72 ℃ 10 min.产物的回收、连接、转化及阳性克隆鉴定同 1.2 节.
1.4 靶基因在正常组织/器官中的表达分析以正常养殖拟穴青蟹的不同组织/器官的cDNA为模板,以β-actin为内参基因进行半定量PCR检测,反应体系如下:上下游引物(SpCrus1b-qF/R、SpCrus2b-qF/R、β -actin,见表1)各0.50 μL,2×EasyTaq PCR SuperMix 12.75 μL,组织cDNA模板1.00 μL,无菌水补充至25.00 μL.PCR反应条件:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s,64 ℃(β -actin)/58 ℃(SpCrus1b、SpCrus2b)30 s,72 ℃ 45 s,其中,β -actin执行25个循环,靶基因执行30个循环; 72 ℃ 10 min.
1.5 脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激后靶基因的表达分析将拟穴青蟹随机分为3组:LPS组、PolyI:C组和对照组.对照组为蟹生理盐水(NaCl 496 mmol/L、KCl 9.52 mmol/L、MgSO4 12.8 mmol/L、CaCl2 16.2 mmol/L、MgCl20.84 mmol/L、NaHCO3 5.95 mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 mmol/L,pH 7.4; 121 ℃高压灭菌20 min); LPS和PolyI:C(均购自Sigma公司)分别溶于蟹生理盐水中,制成质量浓度为2 mg/mL溶液,按200 μL/只于第四步足基部注射,注射后6,12,18和24 h(每组每个时间点随机取3只)采集鳃组织并提取RNA,反转录为cDNA后保存备用.
利用Light Cycle 480 Ⅱ PCR仪(购自Roche公司)分别进行β-actin和靶基因的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测,并在每块96孔板设置5个已知拷贝数的标准品(表2)用以计算引物扩增效率和检测未知样品的拷贝数.PCR反应体系如下:上下游引物(同1.4节,见表1)各0.32 μL,cDNA模板3.00 μL,SYBR Green Ⅰ Master 10.00 μL,无菌水补充至20.00 μL.PCR反应条件:95 ℃ 10 min; 95 ℃ 30 s,64 ℃(β -actin)/58 ℃(SpCrus1b、SpCrus2b)30 s,72 ℃ 25 s,84 ℃(β -actin、SpCrus2b)/81 ℃(SpCrus1b)荧光采集5 s,40个循环.qRT-PCR反应结束后,绘制产物的溶解曲线以检测扩增特异性.
表2 用于qRT-PCR的标准品信息
Tab.2 Information of standard samples used for qRT-PCR数据处理与统计:以β -actin作为内参,对组织样品中靶基因的表达量进行标准化处理.靶基因的相对表达量以同一时间点的刺激组样品标准化表达量与对照组样品标准化表达量的比值表示.采用SPSS软件进行数据统计分析,用Dunnett t-test(2-sided)检验进行差异显著性分析.用Origin8软件作图,数据采用平均值±标准差的方式表示,p<0.05表示差异显著,p<0.01表示差异极显著.
1.6 生物信息学分析用Primer Premier 6.0软件设计引物,并用Oligo 7 Primer Analysis软件进行引物分析; 氨基酸序列多重比对利用DNAMAN和BioEdit Sequence Alignment Editor软件; 用MEAG 5.0软件构建系统进化树.在线工具分析:在NCBI(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行序列BLAST分析; 在网站http:∥www.fr33.net/translator.php和http:∥web. expasy.org/translate/上进行开放阅读框(ORF)的查找与翻译; 用SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测; 用ExPASy(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)预测分子质量和理论等电点; 用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi)预测蛋白质结构域; 用Spidey(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/spideyweb.cgi)分析基因组DNA序列结构; 用SWISS MODEL(http:∥swissmodel.expasy.org/)进行蛋白质三级结构模型构建.
2 结果与分析
2.1 序列分析从拟穴青蟹转录组数据中获得2条Crustin基因序列,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b(图1).经PCR克隆确认两者cDNA全长分别为475和846 bp,ORF长度分别为330和678 bp,分别编码109和225个氨基酸.两者N-端均含有信号肽,长度分别为18和17个氨基酸,成熟肽分子质量分别为10 091.60和20 586.00 u,理论等电点分别为8.49和7.77.两者成熟肽部分均有12个高度保守的半胱氨酸,其中近C-端的8个位于WAP结构域,长度分别为47和51个氨基酸.不同之处在于:SpCrus1b前体肽中信号肽与WAP结构域之间仅有一个CRR(图1(a)),故属于 Ⅰ 型Crustin; 而SpCrus2b前体肽除了具有SpCrus1b的
图1 SpCrus1b(a)和SpCrus2b(b)的序列分析
Fig.1 Sequence analyses of SpCrus1b(a)and SpCrus2b(b)结构性特征外,还含一个GRR(图1(b)),符合典型的Ⅱ型Crustin结构特征.
BLASTP分析显示:SpCrus1b与拟穴青蟹SpCrus6(AUV47158)的序列相似性最高,为59%; SpCrus2b与日本仿长额对虾(Pandalopsis japonica)crusⅡc(AGU01545)的序列相似性最高,为63%.将二者分别与已报道的7条拟穴青蟹Crustins序列进行同一性分析发现:1)序列全长,SpCrus1b与SpCrus2b的一致性和相似性最高(30.27% 和35.77%).2)信号肽部分,SpCrus1b与SpCrus6的一致性和相似性最高(61.11%和66.66%),SpCrus2b与SpCrus5(AUV47159)的一致性和相似性最高(35.29%和52.94%).3)CRR部分,SpCrus1b与SpCrus6的一致性最高,为47.36%; 与CrusSp1(ABY20727)、CrusSp2(ABY20728)和SpCrus5的相似性最高,为66.66%.SpCrus2b与SpCrus5、SpCrus6的一致性最高,为60.00%; 与SpCrus5的相似性最高,为66.66%.4)GRR部分,SpCrus2b与SpCrus5的一致性和相似性最高,均为66.66%.5)WAP部分,SpCrus1b与SpCrus6的一致性和相似性最高(67.30% 和71.15%),SpCrus2b与SpCrus5的一致性和相似性最高(60.78%和62.74%)(附录(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20190410.html)表S1).
2.2 基因组DNA序列结构分析以拟穴青蟹肌肉组织为模板进行PCR扩增,获得了SpCrus1b和SpCrus2b的基因组DNA序列(图1),长度分别为951 bp和1 328 bp.与cDNA序列进行比对后,结果显示:SpCrus1b的基因组DNA序列呈4个外显子/3个内含子结构,其中4个外显子的长度依次为81,154,77和148 bp,3个内含子的长度依次为170,127和194 bp,内含子的相位分别为0,2,0; 与SpCrus1b不同,SpCrus2b的基因组DNA序列呈2个外显子/1个内含子结构,其中2个外显子的长度分别为124和722 bp,内含子的长度为482 bp,内含子相位为0.所有外显子/内含子剪切均遵循GT-AG规则[19-21].
2.3 多重比对将SpCrus1b和SpCrus2b与已报道的甲壳动物代表性物种(附录表S2)中同型Crustins进行多重序列比对,结果显示(图2):12个半胱氨酸在进化上高度保守,其中WAP结构域中的8个半胱氨酸两两连接(C5-C10、C6-C11、C7-C9、C8-C12),共同形成一个紧密的4DSC(four-disulfide core)结构.Ⅰ型Crustins形成“C1-X3-C2-X(7-14)-C3C4-X(6-19)-C5-X(5-6)-C6-X(6-15)-C7-XHDX2-C8-X(4-5)K-C9C10-XDX-C11-X(5-7)-C12”基序,Ⅱ型Crustins形成“C1-X(2-3)-C2-X(7-8)-C3C4-X(4-19)-C5-PX2RX2-C6-PX(8-11)-C7-X2DX2-C8-X(3-4)DK-C9C10-XDX-C11-DX3V-C12”基序,其中X表示任意氨基酸,数字表示氨基酸个数.SpCrus1b与SpCrus2b的主要区别在于C2-C3、C4-C5、C5-C6、C6-C7之间的氨基酸数量不同.此外,在这些Crustins成熟肽中存在一些相对保守的区域或重复基序.
2.4 系统进化分析将SpCrus1b和SpCrus2b全长氨基酸序列与已报道的甲壳动物代表性物种(附录表S2)的Crustins采用邻接(neighbor-joining,NJ)法构建系统进化树,结果显示(图3):Crustins家族可分为5个类型,其中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅴ型在进化上聚为一簇,Ⅲ型和Ⅳ型聚为一簇,这与之前的报道一致[7,10].本研究获得的SpCrus1b与Ⅰ型Crustins聚为一支,其中与拟穴青蟹和远洋梭子蟹(Portunus pelagicus)亲缘关系最近; 而SpCrus2b尽管归于Ⅱ型Crustins,却单独为一支,与同型Crustins亲缘关系相对较远.
每行序列右边的数字表示该行氨基酸数量; 信号肽、GRR、CRR以及WAP结构域均在
序列上方标出,保守区域用框线标出; 12个保守的半胱氨酸在下方用数字依次编号,
其中WAP结构域中8个半胱氨酸形成的4DSC结构用连接线标出.
图2 SpCrus1b(a)和SpCrus2b(b)与已报道的不同甲壳动物中同型Crustins的氨基酸多重序列比对
Fig.2 Multiple amino acid sequence alignments of SpCrus1b(a)and SpCrus2b(b) with the same type Crustins reported from different crustaceans2.5 三级结构预测用SWISS-MODEL对SpCrus1b和SpCrus2b进行三维结构建模,结果显示:两者均与2rel.1.A(R-ELAFIN,R-弹性蛋白酶抑制剂)一致性最高,分别为24.0%和33.3%; 同时发现两者结构类似,均含有3个β折叠(图4).推测两者可能与之前报道相似,具有抑制蛋白酶等生物学功能[22-26].
2.6 在正常拟穴青蟹组织/器官中的分布以β-actin为内参基因,采用半定量PCR分析SpCrus1b和SpCrus2b在正常拟穴青蟹心脏、血淋巴细胞、肝胰腺、鳃、卵巢和上皮中的转录表达情况,结果显示:SpCrus1b和SpCrus2b均主要在鳃中表达,而在其他组织/器官中微量表达甚至未检测到表达(图5).
2.7 LPS和PolyI:C刺激后靶基因的表达变化为了研究靶基因对细菌和病毒的应答情况,利用LPS和PolyI:C分别刺激后检测不同时间点的鳃组织中基因表达情况,结果显示:LPS刺激后,SpCrus1b的表达量呈不同程度上调,且在6和24 h时与对照组相比极显著上调(p<0.01),为对照组的3.44倍和3.64 倍(图6(a)); 除6 h外,SpCrus2b的表达量也均呈不同程度上调,其中在12 h时表达量为对照组的2.39倍(p<0.05),24 h时达到2.71倍(p<0.01)(图6(b)).PolyI:C刺激后,SpCrus1b和SpCrus2b的表达量仅在12 h 时极显著上调(p<0.01),分别为对照组的3.71 倍和2.31倍(图6(c)和(d)).
图3 SpCrus1b和SpCrus2b与Crustins家族成员的系统进化分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of SpCrus1b and SpCrus2b with Crustins family members3 讨 论
3.1 SpCrus1b和SpCrus2b是拟穴青蟹Crustins家族新成员本研究从拟穴青蟹中获得2条新的Crustin基因序列,两者编码的前体肽均具有典型的Crustins结构特征.SpCrus1b与之前拟穴青蟹中报道的Crustins(EU161287、ABY20727、ABY20728、AUV47160、AUV47161)虽同属Ⅰ型Crustins,但在进化上并没有聚为一簇,而是与处于另一分支上的拟穴青蟹AUV47158和远洋梭子蟹ABM65762亲缘关系最近,推测在拟穴青蟹Ⅰ型Crustins中可能存在不同变体,在进化上有共同祖先而随着生物进化过程逐渐分
图4 SpCrus1b(a)和SpCrus2b(b)三级结构分子模型
Fig.4 3D-molecular models of SpCrus1b(a)and SpCrus2b(b)
图5 SpCrus1b和SpCrus2b在正常组织/器官中的表达谱
Fig.5 Expression profile of SpCrus1b and SpCrus2b in normal tissues/organs
图6 LPS和Poly I:C刺激后SpCrus1b和SpCrus2b在鳃中的表达变化
Fig.6 Expression changes of SpCrus1b and SpCrus2b in gills after LPS and Poly I:C challenges散; SpCrus2b虽属于Ⅱ型Crustins,但在位置上却处于分支边缘,推测SpCrus2b可能是Ⅱ型与其他类型之间的过渡类型.
比较分析已报道的Ⅰ型和Ⅱ型Crustins的基因组DNA序列结构,发现Ⅰ型和Ⅱ型Crustins各有3种不同的形式(附录图S1和S2).Ⅰ型Crustins:1)4个外显子/3个内含子,如日本仿长额虾Paj-CrusⅠa[27]、Paj-CrusⅠc[28]、三疣梭子蟹(P. trituberculatus)PtCrustin3[29]和拟穴青蟹CrusSp[15]; 2)3个外显子/2个内含子,如日本仿长额虾Paj-CrusⅠb[28]和三疣梭子蟹PtCrustin2[29]; 3)无内含子,如日本仿长额虾Paj-CrusⅠd、Paj-CrusⅠe和Paj-CrusⅠf[28].Ⅱ型Crustins:1)4个外显子/3个内含子,如斑节对虾(Penaeus monodon)CrustinPm5[30]; 2)3个外显子/2个内含子,如日本仿长额虾Paj-CrusⅡa[28]; 3)2个外显子/1个内含子,如日本仿长额虾Paj-CrusⅡb、Paj-CrusⅡc[28]以及斑节对虾Crus-likePm[13].本研究中SpCrus1b属于4个外显子/3个内含子结构,其WAP结构域横跨后2个外显子; SpCrus2b属于2个外显子/1个内含子结构,其WAP结构域由第2个外显子单独编码.综上可见,尽管Ⅰ型和Ⅱ型Crustins都含有WAP结构域,但其生成机制却存在很大差异.推测WAP结构域中内含子的插入(无内含子的Crustins除外)可能是区别Ⅰ型和Ⅱ型Crustins的关键[31-32].
3.2 SpCrus1b和SpCrus2b主要在鳃中表达Crustins在正常组织/器官中的表达模式复杂多样,其中大多数甲壳动物的Crustins主要在血淋巴细胞中表达,如日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)[33]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[34]和蜘蛛蟹(Hyas araneus)[11]等.本研究获得的SpCrus1b和SpCrus2b表达模式与拟穴青蟹中报道的SpCrus2[16]、SpCrus3[17]SpCrus4[17]和SpCrus5[18]类似,主要在鳃中表达,而在其他组织/器官中表达量极低甚至检测不到表达.基于这些表达模式的差异,推测它们之间可能存在协同作用,共同为机体提供多重、复杂的保护功能[35].
3.3 SpCrus1b和SpCrus2b参与拟穴青蟹抗细菌与抗病毒的免疫应答
LPS存在于革兰氏阴性细菌细胞壁表面,是一种与细菌感染相关的分子模式[36].在Ⅰ型Crustins的细菌诱导实验中,拟穴青蟹SpCrus3[17]在受到副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导后2～48 h内表达量呈下调趋势,且在12 h时最低.SpCrus4[17]在0～2 h 内较对照组没明显变化,而6 h时骤然上升,表达量达到最高(上调近8倍),随后趋于正常水平.本研究中SpCrus1b在LPS诱导后6和24 h时表达量均呈极显著上调(p<0.01),这一结果与SpCrus4类似.在Ⅱ型Crustins抗细菌研究中,拟穴青蟹SpCrus2[16]在受到副溶血弧菌诱导后6～12 h内表达量呈上调趋势,且在12 h时达到最高,上调约1.5倍; 而SpCrus5[18]在相同条件下,2～12 h内表达量呈显著上调,6 h时达到最高(上调约4倍),24 h后下降至正常水平.与之不同的是,本研究中SpCrus2b在LPS诱导后12 h时表达量开始显著上调(p<0.05),24 h时达到最高(p<0.01).推测SpCrus1b和SpCrus2b参与了拟穴青蟹的抗细菌免疫过程,且在机体感染后SpCrus1b的响应更早.
PolyI:C,即多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双链多聚核苷酸(dsRNA),是一种与病毒感染相关的分子模式[37].在已报道的拟穴青蟹Crustins抗病毒研究中,SpCrus3[17]、SpCrus4[17]和SpCrus5[18]在受到白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)诱导后72 h内均无明显变化.本研究获得的SpCrus1b和SpCrus2b在PolyI:C诱导后12 h时表达量均呈极显著上调(p<0.01),由此推测SpCrus1b和SpCrus2b参与了拟穴青蟹机体的抗病毒免疫过程.而Crustins同型不同变体之间对病毒刺激后响应不同,认为其可能存在一定选择性.
4 结 论
本研究从拟穴青蟹中获得Ⅰ型和Ⅱ型Crustin新变体各一个,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b.在序列分析的基础上,比较了两者与同型Crustins的基因组DNA序列结构特点,为Ⅰ型和Ⅱ型Crustins分类提供了新的依据.两者主要在鳃中表达,病原分子模式(LPS和PolyI:C)诱导实验结果显示均参与拟穴青蟹机体的抗细菌与抗病毒免疫过程,为进一步研究Crustins的生物学功能奠定了基础.
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