收稿日期:2018-04-02 录用日期:2018-07-12
基金项目:自治区重点研发计划(2016B03041-2); 新疆维吾尔自治区自然科学基金(2015211A038)
通信作者:373805247@qq.com
基金项目:自治区重点研发计划(2016B03041-2); 新疆维吾尔自治区自然科学基金(2015211A038)
通信作者:373805247@qq.com
黑果枸杞根际促生菌的筛选鉴定及促生能力分析
(新疆师范大学生命科学学院,新疆特殊环境物种保护与调控生物学重点实验室,新疆师范大学沙漠藻研究院,新疆 乌鲁木齐 830054)
Isolation and identification of growth-promoting rhizobacteria from Lycium ruthenicum soil and their promoting effects
LIU Guoqiang,HABDEN Xugela,AI Shanjiang,WANG Hongbin,ZHENG Yong*
(College of Life Science,Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology,Institute of Desert Algae,Xinjiang Normal University,Urumqi 830054,China)
Lycium ruthenicum; plant growth-promoting rhizobacteria; indolo acetic acid; phosphate solubilization; siderophore
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201804002
备注
摘要
全文
图/表
参考文献
以新疆阿克陶县盐碱地中生长的黑果枸杞(Lycium ruthenicum)根际土壤为材料,分离兼具耐盐和良好促生能力的根际促生菌,共得到43株能够耐受1 mol/L NaCl的菌株,其中13株具有溶磷和产铁载体能力,进而在13株菌中筛选出7株具有分泌生长素能力的菌株.通过溶磷、产吲哚乙酸等功能指标对比,选择出4株功能较强的菌株进行盆栽促生实验,结果发现菌株H29和X49能显著促进盐胁迫下黑果枸杞幼苗的生长.与阴性对照相比,H29处理植株的株高、叶片数、根长、地上部鲜质量和干质量分别增加32.86%,41.67%,44.76%,175.00%和114.29%,X49处理植株的根长、根表面积、地下部鲜质量和干质量分别增加51.75%,130.05%,200.00%和250.00%.分子鉴定结果显示H29为链霉菌属(Streptomyces)菌株,X49为微杆菌属(Microbacterium)菌株.上述结果可为开发和推广适合盐碱化土壤的专用生物肥料提供优良菌种.
The rhizosphere soil was exploited from Lycium ruthenicum fields in Akto County of Xinjiang to isolate rhizosphere bacteria with both salt tolerance and the desirable growth-promoting ability.We obtained 43 isolates in total,and all isolates were capable of withstanding 1 mol/L NaCl.From the obtained NaCl-tolerant bacteria,we isolated 13 strains with good tricalcium phosphate-solubilization and siderophore-secretion abilities,and among them,further isolated 7 strains with the ability to produce plant hormone indolo acetic acid(IAA).According to comparative functional analysis,we selected 4 strains with more desirable multi-functional indexes to carry out growth-promoting experiments using pot-cultivated plant materials(i.e.L.ruthenicum seedlings).Compared with the negative control(non-bacteria-treated),H29-treated plants exhibited increases in height,leaf number,root length,upground fresh and dry mass by 32.86%,41.67%,44.76%,175.00% and 114.29%,respectively; and X49-treated plants showed increases in root length,root surface area,underground fresh and dry mass by 51.75%,130.05%,200.00% and 250.00%,respectively.In addition,molecular characterization identified H29 and X49 as genus Streptomyces and Microbacterium,respectively.The above results presented bacteria resource which could be beneficial for developing salinity-soil-specialized bio-fertilizers and their application.
引言
土壤盐碱化是目前世界上较严重的环境问题之一.盐碱化土壤有着独特的土壤组成结构,大多数所含盐的主要成分是NaCl[1],而Na+的过量积累会导致植物细胞内K+-Na+离子失衡,使植物受到严重的渗透胁迫[2-3],主要表现在:1)抑制植物的根对水或一些营养物质的吸收利用[4]; 2)高浓度的盐引起植物中毒,造成组织损伤[1]; 3)高浓度的Cl-抑制硝酸还原酶活性,减弱光合作用,严重影响植物的生长发育[5].应对盐胁迫,利用能促进盐碱地植物生长的根际促生菌是解决盐碱地危害的有效措施之一.
植物根际促生菌(plant growth-promoting rhi-zobacteria,PGPR)是指生存于植物根系附近土壤中或者附生于植物根系上,能显著促进植物生长发育及其对矿物质营养的吸收利用,并能缓解外界环境对植物的胁迫和提高植物抗病虫害能力的一类有益微生物[6].PGPR在进行生命活动和新陈代谢的过程中,可通过对土壤中的有机物和难溶性矿物质的降解来增加土壤中的养分含量,如将土壤中的难溶性磷转化为可溶性磷,供植物直接吸收,进而促进植物生长; 同时可通过分泌植物生长激素(如吲哚乙酸(IAA))、表面活性剂、铁载体等物质直接或者间接地促进植物的生长[7]; 此外还可以保护或缓解植物受到来自环境的有害胁迫,如盐、干旱、重金属和病原菌等[8-10].
黑果枸杞(Lycium ruthenicum)为茄科枸杞属落叶灌木,是典型耐盐碱、抗干旱的盐生植物,主要生长在甘肃、新疆等干旱、半干旱地区的盐碱化土壤中.本研究从新疆阿克陶县黑果枸杞的根际盐碱化土壤中筛选能够耐盐的原生PGPR,并研究其对盐胁迫下黑果枸杞的促生能力,以期为开发和推广适合盐碱化土壤的专用生物肥料提供优良菌种和理论依据.
1 材料与方法
2 结果与分析
2.1 耐盐菌株的筛选共筛选出能耐受1 mol/L NaCl的菌株43株,用于进一步筛选和PGPR特性验证.
2.2 溶磷菌株的筛选对所筛选出的43株耐盐菌进行溶磷性筛选,结果如表1所示:有13株显示出不同大小的溶磷圈,溶磷圈直径为(7.83±0.25)mm～(21.80±0.61)mm,其中X49的溶磷圈直径最大; 菌溶磷量为(21.62±1.83)mg/L～(49.48±0.44)mg/L,其中X49的溶磷量最大; 同时NBRIP液体培养基的pH值由初始的7.20降低到(3.82±0.03)～(4.95±0.04)之间.
表1 菌株溶磷和产铁载体能力测定结果
Tab.1 Determination of phosphate-solubilization and siderophore-secretion abilities of the strains2.3 产铁载体菌株的筛选进一步对这13株溶磷菌进行产铁载体能力筛选,发现其均具有产铁载体的能力,如表1所示,其中菌株X49、X41和H29菌落周围所产生的黄色圈的直径较大,分别为(32.92±1.06)mm,(32.13±0.59)mm和(31.62±2.07)mm.
2.4 产IAA菌株的筛选对这13株产铁载体的菌株继续进行产IAA能力筛选,发现其中有7株具有产IAA能力,在72,96,120 h产IAA的质量浓度如图1所示,其中X49具有最强的产IAA能力,在120 h产IAA的质量浓度达到最大值(55.71±0.65)mg/L.
图1 各菌株在不同时间段的IAA产量
Fig.1 Indole acetic acid production by the isolates in different periods2.5 盐胁迫下接种PGPR对黑果枸杞幼苗生长的影响
基于以上7株PGPR的溶磷能力、产铁载体能力和产IAA能力,选择其中4株综合促生能力较好的菌株(X17、X41、X49和H29)进行盆栽实验.结果显示(表2):与空白对照组相比,阴性对照组幼苗的生长发育受到了严重抑制,除叶绿素总含量外,其他测量的生长指标较空白对照组均显著减小(p<0.05).4株PGPR处理植株与阴性对照组相比,对幼苗的生长均有不同程度的促进效果,其中H29处理的植株株高增加了32.86%,叶片数增加了41.67%,根长增加了44.76%,且地上部(茎)鲜质量和干质量分别增加了175.00%和114.29%(p<0.05); X49处理植株的根长、根表面积、根体积分别增加了51.75%,130.05%和200.00%,且地下部(根)鲜质量和干质量分别增加了200.00%和250.00%(p<0.05).图2显示了各处理组60 d后幼苗地上、地下部分的生长状况.
表2 不同PGPR处理对盐胁迫(300 mmol/L NaCl)下黑果枸杞幼苗生长的影响
Tab.2 Influence of different PGPR treatments on growth of L.ruthenicum in the presence of 300 mmol/L NaCl注:同一行数据后小写字母不同表示不同处理间差异显著(p<0.05).
图2 处理60 d后幼苗生长状况和相应的根系扫描图
Fig.2 The growth status and corresponding root scans of seedlings after 60 d treatment3 讨 论
土壤盐碱化
图3 基于菌株X49(a)和H29(b)16S rDNA序列的邻接法系统发育树
Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic trees based on 16S rDNA sequences of strain X49(a)and H29(b)引起的盐胁迫是对植物生长发育影响最大和最常见的非生物胁迫.磷是植物生长发育所必需的营养元素之一,土壤中的磷95%以上是无效磷[22],植物不能直接吸收利用.前人研究表明植物根际周围存在大量不同种类且溶磷能力各异的溶磷菌,可将土壤中无效磷转变成能被植物吸收的有效磷,提高土壤中磷的利用率,增加土壤肥力[23-24].本研究从盐碱植物黑果枸杞的根际土壤中分离出13株溶磷菌,其中菌株X49展现了较好的溶磷特性,溶磷量最大,为49.48 mg/L,与Patel等[25]在盐碱环境中筛选的15株溶磷菌的最大溶磷量45 mg/L相比略高.本研究中各溶磷菌的培养液pH从初始的7.20降低到3.82～4.95之间,这可能是溶磷菌在溶解磷的过程中释放了一种或者多种有机酸所致.类似地,Rajankar等[26]研究发现,从亚马逊流域的盐碱性土壤中分离出的芽孢杆菌(Bacillus)等细菌能够溶解磷酸盐并释放有机酸,可降低土壤的pH和盐度.本研究发现菌株的溶磷能力和pH降低之间没有相关性,与Elazeem等[27]和Tank等[28]的研究结果类似; 张英等[29]则通过对6株溶磷菌分泌有机酸的种类、数量与溶磷能力的相关性进行研究,发现尽管培养液中有效磷增量与有机酸总量之间大体上呈线性相关,但相关性很弱.因此,溶磷能力和pH降低之间的相关性可能不仅与菌株所分泌的有机酸种类和数量有一定关系,而且与菌株种类及其生活环境有关.在后续实验中可将溶磷能力强的菌株和分泌有机酸能力强的菌株进行组合培养、施用,以达到既能够增加土壤肥力又能够降低土壤pH的效果,从而实现盐碱化土壤的生物改良.
已有研究表明PGPR产生的铁载体可与有害病原菌争夺植物根系周围土壤中的铁元素,从而抑制有害病原菌的生长[30],间接促进植物的生长发育.本研究中筛选的13株溶磷菌都具有产铁载体能力,其中有7株具有较好的产IAA能力,菌株X49在120 h时产IAA质量浓度达到最大值55.71 mg/L,与张东艳等[17]筛选所得菌株的IAA产量相差不大.本研究中还发现菌株X17和X62分别在72和96 h达到IAA产量最大值,而后的时间段IAA产量又有所减少.参考Datta等[31]的结果,这可能是由于在一定时间段内IAA降解酶(如IAA氧化酶和过氧化物酶)的释放使产生的IAA被降解所致,具体作用机制还需进一步研究.
根是植物获得水分和营养物质的最主要器官,根的伸长有利于植物获得水和营养物质.Munns等[32]认为盐胁迫抑制植物生长可能是由于水的可利用性降低或高浓度盐的毒性.IAA可诱导植物根尖细胞分裂,促进根的生长发育,如:刘佳莉等[33]从盐碱地燕麦的根际土壤中筛选出2株产IAA的PGPR,可使根长分别增加24.6%和14.9%; 崔晓双等[34]在植物根际土壤中筛选到一株产IAA的PGPR,鉴定为微杆菌属(Microbacterium)菌株HNcB,接种HNcB可显著增加黄瓜的总根长和根表面积,分别增加21.2%和29.4%.本研究中使用所筛选的4株综合促生能力较好的PGPR分别处理300 mmol/L盐胁迫下的黑果枸杞幼苗,与未接种PGPR的阴性对照相比,发现菌株X49和H29可使盐胁迫下黑果枸杞幼苗根长增加51.75%和44.76%,且大幅度地提高了黑果枸杞幼苗根的体积和表面积,分子鉴定结果显示X49为微杆菌属(Microbacterium)菌株,H29为链霉菌属(Streptomyces)菌株.因此,推测PGPR可通过分泌IAA直接促进根系的发育来提高植物对水分和养分吸收能力,从而缓解盐胁迫对植物生长发育的抑制作用.
对于地上部分的影响方面,本研究发现与阴性对照相比,施用X49和H29可以分别增加黑果枸杞叶片内叶绿素总含量的22.84%和24.37%; 类似地,吴秉奇等[35]发现烟草添加PGPR后叶绿素总含量可增加20.77%.叶绿素含量的增加可以间接促进幼苗的光合作用,Nadeem等[36]和Yong等[37]证实了在盐胁迫下PGPR处理植物可以使叶绿素含量增加并大幅度提高植物的光合作用.因此,PGPR可能通过促进植物叶片内叶绿素合成以满足盐胁迫下植物对营养的需求,从而缓解盐胁迫对植物生长的抑制.
4 结 论
本研究从生长在新疆阿克陶县盐碱地的黑果枸杞根际土壤中筛选出了4株较好的兼具耐盐、溶磷、产铁载体和产IAA能力的PGPR,综合分析盆栽实验结果,发现其中菌株X49和H29可以大幅度地增加盐胁迫下黑果枸杞幼苗的根长、株高和叶绿素含量,有效地缓解了盐胁迫对黑果枸杞幼苗生长的抑制.因此这两株PGPR具有较大的应用潜力,可为盐碱地生物肥料的研制、推广提供优良菌种和理论基础,对生物治理盐碱地具有一定的应用前景.
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1.1 供试材料所用黑果枸杞根际土壤于2016年11月26日采自位于75.52° E,39.00° N,海拔1 555 m的新疆阿克陶县黑果枸杞种植示范基地.采集植株较大且健壮无病虫害的黑果枸杞的根际土壤,装入无菌袋中于低温条件下迅速带回实验室,放置在4 ℃冰箱中保存备用.盆栽所用黑果枸杞种子由新疆师范大学生命科学学院植物学实验室提供.
1.2 培养基PGPR的分离纯化及保存使用LB(Luria Bertani)培养基[11],溶磷菌的筛选使用无机磷(NBRIP)培养基[12],产铁载体菌株的筛选使用铬天青(CAS)固体培养基[13].
1.3 耐盐菌筛选采用梯度稀释涂布培养的方式,将所采集的土壤样品稀释后均匀涂布在加入1 mol/L NaCl的LB固体培养基上,37 ℃培养5 d,根据不同菌落形态分别进行分离纯化.
1.4 溶磷能力测定1.4.1 溶磷圈直径在NBRIP固体培养基中打孔,每板5个直径为6 mm 的孔,各孔中分别加入50 μL生长处于对数期的耐盐菌悬浮菌液(108 cfu/mL,cfu为菌落形成单位),每株菌3个重复板.在37 ℃培养箱中培养15 d后测量各菌的溶磷圈直径,判断菌株的溶磷能力.
1.4.2 溶磷量将产生溶磷圈菌株的0.5 mL悬浮菌液(108 cfu/mL)分别接种于50 mL经灭菌的NBRIP液体培养基中,37 ℃、180 r/min 的摇床中振荡培养5 d,4 ℃、10 000 r/min离心10 min后取上清液,采用钼蓝比色法测定上清液中有效磷的含量,计算溶磷量[14].
1.5 分泌铁载体能力测定在CAS固体培养基中打孔,每板5个直径为6 mm的孔,各孔中分别加入50 μL生长处于对数期的溶磷菌株悬浮菌液(108 cfu/mL),每株菌3个重复板.37 ℃培养箱中培养2 d后,若菌落周围产生黄色圈,则表示该菌株能够分泌铁载体,黄色圈直径大小可反映该菌株分泌铁载体能力大小[15].
1.6 分泌IAA测定1.6.1 定性判断参考Glickmann等[16]的方法,将产铁载体的菌株分别接种于LB液体培养基中(添加0.5 g/L的 L-色氨酸),37 ℃、180 r/min振荡培养2 d,8 000 r/min离心后取50 μL上清液加入100 μL Sackowcki's显色剂,在白瓷板上避光显色30 min后,若出现粉红色则为阳性,表示该菌株能够分泌IAA.
1.6.2 定量测定取阳性菌株的上清液与Sackowcki's显色剂避光显色30 min后的混合液,测定在530 nm的吸光度,以空白培养基作为对照,以纯IAA的吸光度制作标准曲线,计算各反应中阳性菌株产IAA的质量浓度[17].
1.7 盆栽促生效应验证设计3个处理,即盐胁迫下接种PGPR、空白对照(不加NaCl、不接种PGPR)和阴性对照(加入300 mmol/L NaCl、不接种PGPR),各处理3次重复[18].选择直径为20 cm的花盆,每盆装入500 g经高温灭菌的土壤,挑选饱满度较好、大小基本一致的黑果枸杞种子在70%(体积分数)乙醇中表面消毒15 min[19],用灭菌的蒸馏水冲洗3～5次,在37 ℃水浴锅中24 h恒温催芽,每盆种植5颗种子,放置在条件为12 h光照/12 h黑暗、温度25/20 ℃、相对湿度75%的人工气候箱中培养,萌发前每天浇灌等量的蒸馏水,萌发后每隔3 d浇灌一次蒸馏水.14 d后参照Tank等[20]的方法,连续3次浇灌NaCl溶液以保持盐浓度为300 mmol/L,并在相应盆中加入30 mL 108 cfu/mL的PGPR悬浮菌液.60 d后将所有盆中黑果枸杞连根拔起,分别测量叶片数,株高,茎鲜质量和干质量,叶绿素a、叶绿素b含量和叶绿素总含量,根长、根表面积、根体积、根鲜质量和干质量共12项生长指标.
1.8 PGPR菌株鉴定分别提取菌株的基因组DNA,采用通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA的PCR扩增[21],将PCR产物送生工生物工程(上海)有限公司进行测序.测序结果提交至GenBank数据库并进行Blast序列比对分析,使用MEGA7软件通过邻接(neighbour-joining)法构建系统进化树.
