基金项目:国家自然科学基金(21435003,91427304,21521004,J1310024)
通信作者:ybjiang@xmu.edu.cn
(厦门大学化学化工学院,谱学分析与仪器教育部重点实验室,福建 厦门 361005)
(Key Laboratory of Spectrochemical Analysis & Instrumentation,Ministry of Education,College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)
coumarin-hemicyanine; N-acetylneuraminic acid; intramolecular charge transfer; visual recognition
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201805024
以共轭连接的香豆素和半花菁为信号报告基团,以苯硼酸为识别基团,设计合成了一种对唾液酸具有选择性识别的比色型荧光传感分子,命名为CHB,并采用吸收和荧光光谱方法研究其对唾液酸(N-乙酰神经氨酸)及其他糖类分子(如葡萄糖、蔗糖和麦芽三糖等)的响应.结果表明,CHB仅对N-乙酰神经氨酸表现出显著的吸收和荧光光谱响应,并通过高分辨质谱研究证实二者以1:1计量比通过共价作用结合形成复合物.N-乙酰神经氨酸与苯硼酸的共价作用和静电作用共同影响了香豆素-半花菁共轭体系的分子内电荷转移,从而引起显著的溶液颜色变化和高选择性的光谱响应,因此CHB可用于N-乙酰神经氨酸的可视化检测.
A colorimetric and fluorescent chemosensor CHB was designed and synthesized,using a coumarin-hemicyanine conjugate skeleton as the signal reporter and phenylboronic acid as the receptor.The interactions of CHB with N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac)and other saccharides such as glucose,sucrose,maltotriose were investigated using absorption and fluorescence spectroscopy.Significant absorption and fluorescence spectral responses and obvious color changes were only observed in the presence of Neu5Ac,whereas the other saccharides produced weak spectral changes and exerted practically no interference.And it was proved with high resolution mass spectroscopy(HRMS)that CHB and Neu5Ac formed a complex via covalent bonding at a ratio of 1:1.It was suggested that Neu5Ac modulated the intramolecular charge transfer of coumarin-hemicyanine conjugate system in CHB together with the covalent interaction and electrostatic interaction,allowing a highly selective spectral sensing of Neu5Ac,with the potential of visual recognition.
唾液酸是一类重要的九碳单糖衍生物的统称[1],至今在脊椎动物体内已发现超过50种唾液酸衍生物.其中唾液酸在大部分动物体内主要以N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸两种形式存在,而在人体组织中则主要以Neu5Ac形式存在(图1)[2-4],因此唾液酸通常指Neu5Ac.唾液酸位于细胞表面聚糖(如糖脂和糖蛋白)的非还原糖链末端[5],有利于改变细胞表面聚糖的结构,从而调节包括发育和分化在内的不同类型的生理和病理过程[6-10].唾液酸的表达水平与诸多疾病相关,例如其在细胞表面的过度表达可导致多种癌症的恶化和转移[11-13].此外,细胞中存在多种与唾液酸结构类似的糖类物质,对其检测存在诸多干扰.因此探究高选择性、便捷、有效的唾液酸检测方法具有重大意义.
目前报道检测唾液酸的方法主要分为两种类型[14-17]:第一种类型是基于分离唾液酸和糖复合物的检测方法,例如高效液相色谱法[18]和毛细管电泳法[19],由于分离唾液酸的过程复杂,检测操作繁琐耗时,仪器价格昂贵等,致使该类型检测方法的应用受到限制; 第二种类型是无需分离出唾液酸的检测方法,主要为光谱分析法[20],与第一种类型的检测方法相比,该法可直接检测唾液酸,表现出直观的光谱响应,且具有操作简便、设备便宜、采样方式灵活等优势,而且在检测人体内唾液酸方面已有所应用.
光谱分析法常见的有荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法,其关键在于传感分子的设计.传感分子一般由信号报告基团、连接臂、识别基团三部分组成,也有传感分子只包含信号报告基团和识别基团两部分.由于香豆素-半花菁共轭体系具有良好的光学特性,如光稳定性高和斯托克斯位移大等,共轭体系的荧光发射波长位于近红外区(650~900 nm)[21],并且其最大的特点是能产生可视的颜色变化; 而Neu5Ac的顺式-1,2-或1,3-二羟基可与苯硼酸基团通过共价作用形成硼酸酯[3],所以本研究以香豆素-半花菁共轭体系为信号报告基团,以苯硼酸基为识别基团,设计了基于分子内电荷转移(ICT)机理的比色型荧光传感分子,命名为CHB(图1),并通过
质谱、吸收光谱和荧光光谱等手段研究其对Neu5Ac的识别传感,期望实现对Neu5Ac便捷的可视化监测目的.
合成所用有机溶剂均为上海
国药集团化学试剂有限公司的分析纯试剂; 表征所用氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)和甲醇均为Sigma-Aldrich公司试剂; 光谱测试所用乙醇经分子筛干燥后重新蒸馏纯化,甲醇为Sigma-Aldrich公司高效液相色谱试剂,实验用水为纯净水.
Bruker AV 500 MHz和Bruker AV 600 MHz核磁共振波谱(NMR)仪(以四甲基硅烷为内标); Bruker En Apex ultra7.0 FT-MS高分辨质谱(HRMS)仪; Thermo Evolution 300紫外-可见吸收光谱仪; HORIBA Fluorolog荧光光谱仪.
CHB的合成路线如图2所示.
称取0.33 g(2.0 mmol)3-(二乙胺基)苯酚和0.93 g(2.0 mmol)双(2,4,6-三氯苯基)丙二酸酯溶于15 mL无水甲苯中,加热回流反应2 h.反应完毕后将反应液冷却至室温,析出棕灰色沉淀,抽滤除去甲苯溶剂后,所得棕灰色固体依次用甲苯和石油醚多次洗涤,直至得到浅灰色固体A[22],产量0.36 g,产率77.3%.
冰浴条件下,恒压滴加3 mL三氯氧磷至3 mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中,于50 ℃下反应0.5 h.称取0.35 g(1.5 mmol)A溶于10 mL DMF中,并滴加入上述反应液中.升温至60 ℃,搅拌反应12 h.待反应完毕,将反应液冷却至室温后缓慢倒入冰水中,得到橙红色沉淀.过滤,所得橙色固体用二氯甲烷萃取,用饱和食盐水洗涤2次,再用无水硫酸钠干燥.旋转蒸发除去溶剂,得到橙色固体产物B[23],产量0.38 g,产率90.6%.
称取1.43 g(10.0 mmol)2,3,3-三甲基-3H-吲哚与0.64 g(3.0 mmol)4-溴甲基苯硼酸于30 mL乙腈中,加热回流反应12 h.旋转蒸发除去溶剂,粗产物采用硅胶柱层析法提纯,洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(体积比60:1),得到棕黄色固体产物C,产量0.75 g,产率85.0%.
称取0.28 g(1.0 mmol)B和0.37 g(1.0 mmol)C溶于20 mL无水乙醇中,搅拌回流反应12 h.旋转蒸发除去乙醇得到紫红色固体,采用硅胶柱层析法纯化产物,洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(体积比6:1),得到深蓝色固体产物,产量0.39 g,产率61.3%.产物经1H-NMR、13C-NMR和HRMS(电喷雾(ESI))表征,鉴定为目标产物CHB.1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6):δ 8.42(d,J=15.4 Hz,1H),8.17(d,J=15.4 Hz,1H),7.94~7.89(m,1H),7.83(d,J=9.4 Hz,1H),7.80(d,J=8.0 Hz,1H),7.76(d,J=7.8 Hz,1H),7.66(d,J=7.4 Hz,1H),7.63~7.58(m,1H),7.38(d,J=6.8 Hz,1H),7.33(d,J=8.0 Hz,1H),7.28(d,J=7.4 Hz,1H),7.02(dd,J=9.5,2.3 Hz,1H),6.74(d,J=2.2 Hz,1H),6.60(s,1H),6.31(s,1H),5.77(s,1H),5.33(s,1H),3.60(dd,J=13.9,6.8 Hz,2H),3.46~3.36(m,2H),1.83(s,3H),1.73(s,3H),1.18(t,J=7.0 Hz,3H),1.12(t,J=7.0 Hz,3H).13C-NMR(214 MHz,DMSO-d6):δ 167.40,141.17,140.73,139.28,136.69,135.39,135.13,134.91,132.20,132.19,132.18,131.98,131.93,129.13,129.10,128.96,127.24,126.39,126.29,125.27,123.58,122.93,115.01,111.65,67.86,67.09,29.17,28.84,19.32,18.64,13.84,12.83.HRMS(ESI):[C32H33BClN2O4+MeOH-H2O]+ m/z=569.237 3(计算值),569.238 0(测定值).
称取1.337 g氯化铵固体溶于500 mL纯净水,用pH 10.0 的氢氧化钠调节溶液的pH,制得0.05 mol/L pH 8.0 的氯化铵-氨水缓冲液.实验前将乙醇与该缓冲液按照实验所需体积比混合即为光谱测试溶剂.
称取0.025 g传感分子CHB,置于10 mL容量瓶中,用色谱纯甲醇溶解并定容,配制成4.0 mmol/L的CHB储备液.
分别称取1.0 mmol Neu5Ac及其他糖类干扰物(葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、龙胆二糖、纤维二糖和麦芽三糖),溶于10 mL纯净水,配制成0.1 mol/L的母液.
移取10 μL CHB储备液于装有2 mL光谱测试溶剂的石英槽中,加入2~20 μL Neu5Ac母液,对其进行吸收光谱和荧光光谱测试,其中荧光光谱的激发波长为597 nm,激发和发射的狭缝宽度均为3 nm.
向装有2 mL光谱测试溶剂的石英槽加入10 μL CHB储备液,再加入20 μL其他糖类干扰物的母液,最后加入20 μL Neu5Ac的母液,制得选择性竞争实验溶液,并进行吸收光谱和荧光光谱测试.
往光谱测试溶剂中,加入n(CHB):n(Neu5Ac)=1:1混合物,使用HRMS仪检测混合物的MS谱图.
ICT与分子结构中电子给体和受体的得失电子能力有关.如图3所示,分子CHB中存在电子给体和受体,其中氯原子作为拉电子基团,氮原子则具有给电子能力,但由于分子CHB上的半花菁端氮原子带正电荷,电荷密度减小,削弱了其给电子能力,致使ICT受限,溶液呈现浅黄色.当Neu5Ac的顺式-1,2-或1,3-二羟基与苯硼酸基团通过可逆共价相互作用结合形成带负电荷的硼酸酯,并且Neu5Ac脱质子带负电荷,与CHB的氮正电荷之间存在静电作用,极大程度地增加了半花菁端氮原子的电荷密度,提高了其给电子能力,促进了ICT,从而产生由浅黄色到蓝色的肉眼可见的溶液颜色变化.通过HRMS(ESI)测得二者复合物的m/z=828.309 4,与[C43H48BClN3O11]+理论值828.306 5相符,可知Neu5Ac与CHB的苯硼酸基团按1:1计量比结合形成复合物.
苯硼酸的pKa为8.6[24],与Neu5Ac的顺式-1,2-或1,3-二羟基在pH > 8介质中结合为宜,与Neu5Ac的α-羟基酸在pH为2~8范围内结合为宜[3].通过pH条件优化在弱碱性条件下苯硼酸与二醇的作用效果较佳,故本文中选择pH 8.0作为CHB与Neu5Ac作用的优化pH条件.在该条件下,探讨了混合溶剂中乙醇的体积分数对CHB与Neu5Ac作用的吸收与荧光光谱的影响.由图4(a)和(b)可知,在纯水介质中CHB与Neu5Ac作用的光谱变化最小,随着乙醇体积分数增加,其光谱响应越来越显著,但是当乙醇的体积分数达100%时,光谱变化反而减小.并且发现当乙醇的体积分数为70%时,CHB与Neu5Ac作用后的吸收和荧光光谱响应最佳.
图4(c)所示为以不同体积分数的乙醇与氯化铵-氨水缓冲液为混合溶剂的CHB溶液在加入Neu5Ac前后的颜色变化.发现在纯氯化铵-氨水缓冲液中CHB显浅蓝色,在纯乙醇溶液中呈浅黄色; 改变乙醇的体积分数时,CHB自身的颜色也随之改变.加入Neu5Ac后溶液均变为蓝色或深蓝色,呈现显著的颜色变化,尤其在乙醇体积分数为70%的混合溶剂中,CHB自身及其与Neu5Ac作用c(CHB)=20 μmol/L,溶剂为乙醇与0.05 mol/L pH 8.0的氯化铵-氨水缓冲液的混合溶剂.
5Ac后的颜色变化最为显著.因此,CHB与Neu5Ac作用的优化溶剂条件是乙醇与0.05 mol/L pH 8.0 的氯化铵-氨水缓冲液按体积比7:3混合.在优化的溶剂条件下,考察了不同浓度Neu5Ac存在下CHB的吸收光谱和荧光光谱(图5).由于香豆素和半花菁之间的ICT效应,CHB除了表现出2个生色团,即香豆素(430 nm)和半花菁(508 nm)各自的吸收峰外,在长波长处还具有典型的ICT紫外吸收峰(597 nm)和荧光发射峰(658 nm).随Neu5Ac浓度增加,香豆素-半花菁共轭体系在597 nm处ICT吸收信号逐渐增强,430 nm处香豆素吸收峰信号逐渐减弱,465 nm处出现等吸收点,溶液颜色由浅黄色转变为蓝色(图5(a)),说明Neu5Ac与CHB作用后形成了稳定的复合物,且增强了香豆素-半花菁共轭体系的ICT.此外,c(CHB)=20 μmol/L,c(Neu5Ac)=0~1.0 mmol/L,
溶剂为乙醇与0.05 mol/L pH 8.0的氯化铵-氨水缓冲液按体积比7:3混合,激发波长为597 nm.Neu5Ac浓度随箭头方向依次增大.
图5 CHB随Neu5Ac浓度变化的吸收光谱(a)、吸光度比值关系曲线(b)、荧光光谱(c)和荧光强度关系曲线(d)
Fig.5 Absorption spectra(a),plot of absorbance ratio(b),fluorescence spectra(c)and plot of fluorescence intensity(d)of CHB versus concentration of Neu
此外,为了探讨CHB对Neu5Ac的定量检测情况,考察了CHB与Neu5Ac作用的线性关系曲线,如图6所示,其线性方程为A=0.000 44×c(Neu5Ac)+0.095.由此计算得CHB的检测限为18.8 μmol/L(3σ/k,n=11),远低于人体中Neu5Ac的正常浓度(1.5~2.5 mmol/L)[25],表明CHB有望用于人体中Neu5Ac的检测,为定量检测Neu5Ac提供了一种新的设计思路.
c(CHB)=20 μmol/L,c(Neu5Ac)=0~20 μmol/L,溶剂为乙醇与0.05 mol/L pH 8.0的
氯化铵-氨水缓冲液按体积比7:3混合.
Neu5Ac为九碳单糖衍生物,其顺式-1,2-或1,3-二羟基可与CHB的苯硼酸基团共价可逆结合形成硼酸酯.由于其他糖类也具有顺式-1,2-或1,3-二羟基,因此进一步开展了选择性和竞争实验.
考察了相同浓度和介质条件下CHB分别与Neu5Ac或其他糖类分子作用时的吸收光谱、荧光光谱和溶液颜色变化(图7).结果发现除Neu5Ac能够引起显著的光谱变化外,其他糖类分子与CHB作用均未能产生明显光谱响应(图7(a)和(b)),且仅Neu5Ac存在时溶液颜色由浅黄色变为蓝色,其他糖类分子的加入均未能引起溶液颜色变化(图7(c)).这可能是由于在该条件下,一方面其他糖类分子的顺式-1,2-或1,3-二羟基与CHB的苯硼酸基团结合能力较Neu5Ac弱,另一方面其他糖类分子不含负电荷,与CHB之间不存在静电作用,所以较之Neu5Ac,其他糖类分子无法调控CHB分子内电子给体和供体的得失电子能力及影响ICT过程,从而表现出CHB仅对Neu5Ac的高选择性光谱响应和肉眼可见的颜色变化.
为进一步考察其他糖类分子对Neu5Ac与CHB的竞争结合,向上述溶液中各加入1.0 mmol/L Neu5Ac,记录其吸收及荧光光谱(图7(a)和(b)).由图可见,含糖溶液中加入Neu5Ac后,吸收和荧光信号均发生显著变化,且与客体分子仅Neu5Ac存在时的变化一致,说明其他糖类分子的加入对CHB与Neu5Ac作用的干扰较弱.这种现象归因于CHB与Neu5Ac之间的共价作用和静电作用相互配合,使得其结合能力远强于其他糖类分子,致使其他糖类分子与Neu5Ac竞争CHB的能力极弱.
葡萄糖是人体内的重要糖类分子,正常浓度为4.0~7.0 mmol/L[26],Neu5Ac在人体内位于糖蛋白的糖链末端,正常浓度为1.5~2.5 mmol/L[25].由此考虑人体内的葡萄糖最有可能干扰传感分子对Neu5Ac的检测.为此,特别考察了不同浓度的葡萄糖对CHB与低浓度Neu5Ac作用的干扰情况.由图8可知,高浓度的葡萄糖也未使CHB产生明显的光谱响应,而且对CHB与Neu5Ac作用的干扰较小,说明人体内正常浓度的葡萄糖不会影响本方法对Neu5Ac的检测.综上实验结果表明,CHB对Neu5Ac有高选择性且二者的作用不受其他糖类分子的干扰,在不分离Neu5Ac和糖复合物的条件下,也能够实现对Neu5Ac的便捷检测.
图7 CHB与其他糖类分子作用及加入Neu5Ac前后的吸光度(a)、荧光强度(b)和溶液颜色变化(c)
Fig.7 The absorbance(a)and fluorescence intensity(b)and color changes(c)of CHB in the presence of other saccharides with or without Neu5Ac
c(CHB)=20 μmol/L,c(Neu5Ac)=0.25 mmol/L,c(glucose)=0~7.0 mmol/L,
溶剂为乙醇与0.05 mol/L pH 8.0的氯化铵-氨水缓冲液按体积比7:3混合.
以共轭的香豆素和半花菁为荧光基团,苯硼酸基团作为识别位点,设计合成了基于ICT机理的比色型荧光传感分子CHB.HRMS结果证明CHB与Neu5Ac按1:1计量比通过共价作用形成复合物,加之二者间的静电作用共同影响了分子内的电荷密度,有利于香豆素-半花菁共轭体系的ICT,使共轭体系的吸收及荧光强度显著增强,溶液由浅黄色变为蓝色,实现了对Neu5Ac的可视化检测.CHB对Neu5Ac的检测限为18.8 μmol/L,远低于人体内Neu5Ac的正常浓度,且选择性和竞争实验均表明CHB对Neu5Ac的作用具有高选择性和强抗干扰能力,因此CHB在检测人体内Neu5Ac方面具有优势.本研究结果为设计唾液酸的高选择性的新型荧光传感分子提供了新的思路.