基金项目:国家虾产业技术体系项目(CARS-48); 福建省科技厅重大专项专题项目(2016NZ0001-4); 福建省海洋高新产业发展专项项目(闽海洋高新[2014]12号); 厦门海洋经济创新发展示范项目(16CZY009SF05)
通信作者:yqsu@xmu.edu.cn
(College of Ocean and Earth Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201612035
为了研究对虾科(Penaeidae)对虾的系统发育关系,基于2种细胞核蛋白编码基因钾钠腺苷三磷酸α亚基(NaK)基因和磷酸烯醇丙酮酸激酶(PEPCK)基因,使用邻接(neighbor-jointing,NJ)法构建了9属16种对虾的系统发育树.研究结果有力地支持了1983年Burkenroad提出的三群体分类系统,除新对虾属处于进化树最先起源的位置外,系统发育树形成3个进化枝,其一为对虾属、明对虾属、滨对虾属、囊对虾属和沟对虾属,其二为仿对虾属和鹰爪虾属,其三为赤虾属,分别对应为Penaeini、Trachypenaeini和Parapenaeini 3个群体.基于核基因的系统发育树很好地解决了线粒体基因构建的系统发育树中对虾属和明对虾属进化关系不明确的问题,赤虾属的进化关系也很好地符合了形态学分类结果,因此可以作为对虾系统进化研究的重要补充手段与其他的研究方法联合应用.
In order to study the phylogenetic relationship of penaeid shrimps(Penaeidae),the phylogenetic tree of 16 species of penaeid shrimps from 9 genera was constructed using a neighbor-jointing method based on the nuclear protein-coding genes NaK(sodium-potassium ATPase α-subunit)and PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase).The result vigorously supports the three-tribe scheme proposed by Burkenroad in 1983 with three clades resolved:Penaeus sensu strict,Fenneropenaeus,Litopenaeus,Marsupenaeus and Melicertus as clade Ⅰ,Parapenaeopsis and Trachypenaeus as clade Ⅱ,and Metapenaeopsis as clade Ⅲ,corresponding to the Penaeini,Trachypenaeini,and Parapenaeini,respectively,except for Metapenaeus at the root of the phylogenetic tree.The phylogenetic tree of nuclear genes solves the obscure evolutionary relationship between Penaeus sensu stricto and Fenneropenaeus,which cannot be explained by the phylogenetic tree built based on mitochondrial genes.The phylogenetic relationship among the Metapenaeopsis is also well consistent with the result of the morphological classification.Accordingly,it can be used as an important complement to the phylogeny of penaeid shrimps,with the assistance of other methods.
对虾隶属于节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)游泳亚目(Natantia)对虾科(Penaeidae),分为26个属,共200多种[1-2].对虾在全世界甲壳类水产产业中具有非常重要的经济价值[2-5].它们通常也被认为是十足甲壳类动物中最原始的群体[4,6].
尽管对虾的分类学已经得到了广泛的研究,但是关于对虾的系统发育关系仍存在一定的争议,目前仅有2种全面的分类系统被提出.Kubo[7]将对虾科分成5个群体,但是没有对这5个群体进行正式命名,除了认为单源的长眼对虾属(Miyadiella)是最先起源之外并未提及其他群体的内部关系.但是长眼对虾属的分类学地位存在较大的争议,一些学者认为长眼对虾属的对虾只是异对虾属(Atypopenaeus)对虾的幼体期[2].另一种分类系统由Burkenroad[8]提出,将对虾科分成3个群体,分别命名为Penaeini、Trachypenaeini和Parapenaeini,并假定Penaeini是其中最先起源的群体.Burkenroad只划分了15个对虾属,认为浮对虾属(Pelagopenaeus)是软颚虾属(Funchalia)的一个亚属,并且表示鹰爪虾属(Trachypenaeus)和Xiphopenaeus之间的差异不明显,该系统与Dall等[4]和Farfante等[2]的一致.Dall等[4]划分了17个属,将上述4种分类单元都提升到属; 而Farfante等[2]的分类系统将对虾属(Penaeus)的6个亚属和鹰爪虾属的4个亚属分别提升到属,并认为长眼对虾属是一个单独的属.
目前,已有一些分子系统发育研究用于阐述对虾科的进化史[9-12],但是大多都是使用线粒体和细胞核核糖体DNA进行研究,具有一定的局限性:线粒体DNA的快速替换饱和限制了其在深层次系统发育分析中的应用; 细胞核核糖体DNA在序列分析时排列结果不可靠.这些缺点使系统发育分析变得复杂并且阻碍了准确的系统发育树的建立.然而,核蛋白编码基因(简称核基因)作为一种标记用于系统发育分析有明显的优点,不仅在分析时易于排列,并且在基因组中具有很多可以用于系统发育分析的潜在基因.因此,核基因被广泛应用于脊椎动物和昆虫的系统发育分析.钾钠腺苷三磷酸α亚基(NaK)基因和磷酸烯醇丙酮酸激酶(PEPCK)基因2种核基因在动物中参与了基本的细胞功能,并且在进化过程中相当保守.近期有研究使用NaK和PEPCK基因分别分析了十足目以及对虾科的系统发育关系[13-14],取得了较好的结果,表明这2种核基因在对虾科的系统发育关系分析中具有较好的应用.Yang等[15]使用NaK、PEPCK、16S rRNA、12S rRNA和COI基因研究了拟对虾属(Parapenaeus)中大部分对虾的系统发育关系,Cheng等[16]使用NaK、PEPCK和COI基因研究了赤虾属(Metapenaeopsis)中部分对虾的系统发育关系,都取得了较好的结果,但均局限于单属内对虾的系统发育分析.因此,有必要研究NaK和PEPCK基因在对虾科不同属对虾的系统发育关系中的应用.
本研究基于9个属的16种对虾,使用NaK和PEPCK基因探究了对虾科的系统发育关系,以期为对虾科系统进化研究提供一定的参考.
实验所用的对虾科9属16种对虾购买于广西省北海市和福建省漳州市当地海鲜市场,分别为周氏新对虾(Metapenaeus joyneri)、刀额新对虾(M. ensis)、戴氏赤虾(Metapenaeopsis dalei)、音响赤虾(M.stridulans)、须赤虾(M. barbata)、门司赤虾(M. mogiensis)、高脊赤虾(M. lamellata)、角突仿对虾(Parapenaeopsis cornuta)、中华仿对虾(P. sinica)、鹰爪虾(T. curvirostris)、宽沟对虾(Melicertus latisulcatus)、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、短沟对虾(Penaeus semisulcatus)、斑节对虾(P. monodon)、长毛明对虾(Fenneropenaeus penicillatus)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei).所有活体标本浸泡于80%~100%(体积分数)乙醇中,于-20 ℃冰箱保存备用; 标本详细信息见表S1(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20170612.html).选取披针单肢虾(Sicyonia lancifer)为外群.试验个体根据文献[2]鉴定到种.
实验前将肌肉从酒精中取出,用蒸馏水洗净后充分晒干并剪碎,采用酚-三氯甲烷法提取基因组DNA[17],用1.2%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测,并稀释到合适浓度作为模板进行PCR扩增,引物分别为:PEPCK for2(5'-GCAAGACCAACCTGGCCATGATGAC-3')、PEPCK rev3(5'-CGGGYCTCCATGCTSAGCCARTG-3')和NaK for-a(5'-GTGTTCCTCATTGGTATCATTGT-3')、NaK rev2(5'-ATAGGGTGATCTCCAGTRACCAT-3')[13],引物序列中Y表示C或T,S表示C或G,R表示A或G.PCR反应体系:10×PCR buffer 2.5 μL,12.5 mmol/L MgCl2 1.5 μL,10 mmol/L dNTPs 2 μL,10 μmol/L 正、反向引物各1 μL,DNA模板约50 ng,Taq DNA聚合酶1 U,加灭菌蒸馏水至25 μL.PCR反应程序:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s,55~60 ℃(具体退火温度取决于个体)30 s,72 ℃ 90 s,循环35次; 72 ℃ 10 min[13].PCR产物纯化后由华大基因公司ABIPRISMTM 3730XL DNA Analyzer测序仪完成测序,测序引物为PCR扩增引物.
测序后用ClustalX软件[18]进行序列比对,并辅以手工校正.采用MEGA 6.0软件[19]进行数据处理及群体遗传结构分析,计算核苷酸组成及种内、种间遗传距离; 每种对虾选取一条代表序列,基于Kimura双因子参数模型,采用邻接(neighbor-jointing,NJ)法分别构建基于NaK基因、PEPCK基因及NaK和PEPCK基因合并序列的系统发育树,节点的置信度检验采用bootstrap分析(1 000个循环).
将扩增得到的16种对虾的NaK和PEPCK基因序列同外群披针单肢虾的NaK和PEPCK基因序列用ClustalX软件比对后,分别剪切成534 bp和549~553 bp的片段,用MEGA 6.0软件统计后,各片段核苷酸组成如表1所示.
表1 对虾科16种对虾和披针单肢虾的NaK和PEPCK基因片段核苷酸组成
Tab.1 Nucleotide compositions of NaK and PEPCK genes of 16 species of Penaeidae and S. lancifer%
16种对虾的NaK基因同源片段中有405个碱基为保守位点,有129个位点存在核苷酸突变,突变率为24.2%; A、T、C、G的平均含量分别为25.3%,26.1%,23.6%和25.0%,A+T的平均含量为51.4%.16种对虾的PEPCK基因同源片段中有350个碱基为保守位点,有204个位点存在核苷酸突变,突变率为36.8%; A、T、C、G的平均含量分别为23.8%,19.1%,31.5%和25.6%,A+T的平均含量为42.9%.
将对虾科9属16种对虾NaK和PEPCK基因片段的比对结果输入MEGA 6.0软件,以披针单肢虾作为外群,计算16种对虾两两之间的相对遗传距离并构成矩阵,如表2所示:在16种对虾中,NaK与PEPCK基因的最小遗传距离分别为0.001和0.012,都出现在戴氏赤虾和门司赤虾之间,说明二者亲缘关系较近.NaK基因的最大遗传距离为0.128,出现在长毛明对虾和角突仿对虾之间; PEPCK基因的最大遗传距离为0.199,出现在高脊赤虾和鹰爪虾、周氏新对虾和音响赤虾之间.
以披针单肢虾为外群,用NJ法分别构建对虾科9属16种对虾的NaK基因、PEPCK基因以及NaK和PEPCK基因合并序列的系统发育树,见图1.构建的3种树拓扑结构较相似,但不同之处在于基于PEPCK基因构建的系统发育树中新对虾属与鹰爪虾属和仿对虾属聚为一枝,但在另外2种树中新对虾属不与鹰爪虾属和仿对虾属聚在一起; 此外,长毛明对虾和高脊赤虾在3种树中的位置也有所不同.所研究的对虾科9属16种对虾,除新对虾属外,形成3个明显的分枝:仿对虾属的角突仿对虾、中华仿对虾与鹰爪虾属的鹰爪虾聚为一枝; 赤虾属的戴氏赤虾、门司赤虾、高脊赤虾、须赤虾和音响赤虾聚为一枝; 对虾属的斑节对虾、短沟对虾,明对虾属的长毛明对虾,滨对虾属的凡纳滨对虾,沟对虾属的宽沟对虾及囊对虾属的日本囊对虾聚为一枝.
本研究基于NaK基因序列建立的系统发育树中,对虾属的斑节对虾和短沟对虾会被长毛明对虾分开而不能聚为一枝; 但在基于PEPCK基因序列以及NaK和PEPCK基因合并序列构建的系统发育树中,对虾属的斑节对虾和短沟对虾能够聚为一枝.而之前的一些基于COI和16S rRNA基因序列的系统发育分析不能很好地解决斑节对虾与对虾属中其他对虾以及与明对虾属中对虾的关系,在所建的系统发育树中,对虾属的斑节对虾与短沟对虾总会被明对虾属的虾分开[11-12,20].因此,基于PEPCK基因序列以及NaK和PEPCK基因合并序列的分析能很好地解决这一问题,也很符合形态学上通过有无肝脊区分对虾属(有肝脊)和明对虾属(无肝脊)的结果[21].
赤虾属对虾的形态学主要分类特征是头胸甲后方有无下缘响器[21].本研究中赤虾属的音响赤虾和须赤虾头胸甲后缘具有响器,高脊赤虾、门司赤虾以及戴氏赤虾的头胸甲后缘无响器.在单独基于NaK基因和PEPCK基因序列构建的系统发育树中,高脊赤虾未能和具有相同形态特征的门司赤虾和戴氏赤虾聚在一起; 而基于PEPCK和NaK基因合并序列所构建的系统发育树中,音响赤虾和须赤虾聚为一枝,高脊赤虾、门司赤虾和戴氏赤虾则聚为另外一枝.因此,基于NaK和PEPCK基因合并序列的分析结果与形态学分类结果一致,并且其中门司赤虾和戴氏赤虾的关系相较于高脊赤虾更为亲近,这也符合形态学上高脊赤虾的额角及额角后脊呈鸡冠状而门司赤虾和戴氏赤虾的额角宽、下缘突出呈薄片状的特征[21].
综上所述,基于NaK和PEPCK基因合并序列的系统发育树在研究对虾的系统发育关系上有一定的优势.
各分枝上的数字为Bootstrap 1 000个循环的自举检验值.
图1 基于NaK基因序列(a)、PEPCK基因序列(b)及NaK和PEPCK基因合并序列(c)构建的系统发育树
Fig.1 Phylogenetic trees based on NaK gene sequences(a),PEPCK gene sequences(b)
本研究中基于NaK和PEPCK基因合并序列构建的系统发育树的第一进化枝包含对虾属、明对虾属、滨对虾属、沟对虾属和囊对虾属,属于Penaeini群体,其中囊对虾属和沟对虾属聚为一枝,表明二者亲缘关系接近,这与形态学分类结果一致; 滨对虾属、明对虾属和对虾属聚为另外一枝,但对虾属在分子水平上相较于滨对虾属而言,与明对虾亲缘关系更近,这与形态学分类结果有差异.分子系统发育研究表明当前的形态学分类可能不能很好地显示对虾属、明对虾属和滨对虾属之间的亲缘关系,有待进一步研究.第二进化枝包含赤虾属,属于Parapenaeini群体.第三进化枝包含鹰爪虾属和仿对虾属,属于Trachypenaeini群体,而新对虾属在第三进化枝外.Voloch等[11]使用16S rRNA和COI基因研究对虾的系统发育关系中新对虾属也未和鹰爪虾属、仿对虾属聚在一起,因此,对于新对虾属的分类地位还应进行更多的研究.
致谢:非常感谢厦门大学海洋与地球学院的王德祥老师在形态学鉴别对虾过程中给予的帮助.