基金项目:国家自然科学基金(51403043,51103123); 福建省阻燃与防火材料技术重大研发平台项目(2014H2006)
通信作者:hyug@gzhmu.edu.cn
(1.广州医科大学药学院,广东 广州 511436; 2.厦门大学 材料学院,福建省防火阻燃材料重点实验室,福建 厦门 361005)
(1.School of Pharmaceutical Sciences,Guangzhou Medical University,Guangzhou 511436,China; 2.Fujian Provincial Key Laboratory of Fire Retardant Materials,College of Materials,Xiamen University,Xiamen 361005,China)
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201703043
合成聚肽(synthetic polypeptides)在靶向递送、组织工程和再生医学领域表现独特,但其僵硬的主链构象导致难以用电纺的方法制备聚肽纳米纤维,而且后续的表面改性通常会破坏纤维的形貌,因而限制了这类材料的应用.为此,使用聚肽和聚己内酯(PCL)共混电纺的方法制备了一类新型的纳米纤维,并利用巯-炔(Thiol-Yne)光点击反应快速、高效、无损伤地对其表面进行改性.采用扫描电镜(SEM)、傅里叶变换红外(FT-IR)光谱和X射线光电子能谱(XPS)对其进行表征,结果显示:共混纤维的直径和形貌受聚肽含量的影响,而Thiol-Yne表面改性和后处理对纤维的形貌没有影响,这说明所制备的纤维的稳定性很好; 利用温和的Thiol-Yne光点击反应可以成功地将氨基引入到纤维表面.
Synthetic polypeptides are unique biomaterials in the field of drug/gene delivery,tissue engineering and regenerative medicine.But electrospinning nanofibers used for tissue engineering are hard to be fabricated as a result of the rigid backbone of polypeptides caused by their α-helix and β-sheet conformations.In addition,the subsequent surface modifications of electrospinning nanofibers probably destroy the nanofibers.Thus,the fabrication and application of the electrospinning nanofibers of synthetic polypeptides are limited.In this work,electrospinning polypeptide/polycaprolactone(PCL)blend nanofibers were fabricated and then undergone surface modification by thiol-yne click chemistry,a fast non-destructive and highly effective access.Results of scanning electron microscope(SEM)and Fourier transform-infrared(FT-IR)spectroscopy showed that diameter and orientation of the nanofibers were determined by the polypeptide contents,and the surface modification did not destroy the surface morphology.X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)confirmed the amine modification of the surface by the gentle thiol-yne method.
合成聚肽(synthetic polypeptides)是一类经由N-羧基环内酸酐(NCA)开环聚合得到的多肽,通常主链只含有一种氨基酸残基,因此称为聚肽[1-2].这种制备方法允许一次性制备高达数克的高分子量聚肽.聚肽虽然不能够像天然蛋白一样呈单一分子量分布,但Deming[3]发展的过渡金属引发剂开启了制备单分散聚肽的时代,极大地促进了这类材料在高分子科学领域,特别是在生物医用高分子材料领域的应用.聚肽虽然结构简单,但仍可以像天然蛋白一样具备α-螺旋和β-折叠二级结构,这赋予了链段在溶液和本体中呈现独特的自组装能力.从纳米生物医学的角度看,聚肽虽然具有α-螺旋和β-折叠二级结构,但仅含一种氨基酸单元的特点使它们化学结构单一,不能够充分模拟生物体内的天然大分子(如蛋白质、糖蛋白、蛋白多糖等)的功能.因此,2009年以来,快速、高效地增加聚肽的化学复杂性,进而丰富其功能成为研究的重点.Hammond课题组[4]于2009年率先利用铜盐催化叠氮-炔环加成反应(CuAAc)在聚肽侧链以100%的效率接枝聚乙二醇.与此同时,陈学思课题组[5]也用同样的方法将单糖接枝到聚肽侧链,制备了基于聚肽的糖蛋白类似物.CuAAc法的缺点是金属铜盐具有细胞毒性,故而Sun等[6]用不含铜盐的巯-烯(Thiol-Ene)光点击反应快速、高效地实现了聚肽的侧链功能化.一个炔基或双键分别只能和一个叠氮基团或巯基反应,因而以上两种方法对增加聚肽的化学复杂性还比较有限.巯-炔(Thiol-Yne)光点击反应是一种全新的不使用铜盐、温和且高效的化学改性方法,近年来被广泛用于新型高分子功能材料的制备[7-8].在Thiol-Yne光点击反应中,一个炔基可以连续和两个巯基加成,根据这个特点,黄玉刚等[9]率先实现了用功能性巯基分子高效率改性聚肽侧链,更有效地增加了聚肽的化学复杂性.此后很短的一段时间内,科学家们发展了各种增加聚肽化学结构多样性的方法,包括用新型功能化单体制备聚肽,利用各种各样的功能分子将聚肽侧链聚合后改性,开发和使用新的活性聚合方式制备聚肽共聚物等[10-11].
2012年以来,该领域的研究重点逐渐转向使用新型功能性聚肽发展更有效率的纳米递送系统,最核心的工作包括两个层面:1)使聚肽链段具备模拟天然生物大分子的结构和生物活性的能力,以此为思路开发更加智能化的纳米递送系统; 2)利用聚肽和天然蛋白构象类似的特征,以构象为切入点设计更好的纳米递送载体.这两个层面的工作都是基于合成聚肽链段的生物仿生性能,可以使获得的载体更为高效[12-27].尽管基于聚肽的生物材料在药物/基因递送方面表现出色,但在组织工程层面进展甚微,这是因为聚肽的溶解性较差且本体加工性也不好,所以限制了它们作为组织工程材料的应用.电纺是一种简便的制备组织工程用高分子微/纳米纤维的重要方法[28],但目前还甚少见使用该法制备合成聚肽类纳米纤维.此外,在组织工程的实际应用中,通常需要对纳米纤维进行表面改性,以促进/抑制蛋白、细胞和细菌等在纤维表面的生物黏附[29].由此可见,表面改性技术至少要满足无损伤性、效率高以及可靠性好等基本要求.
聚己内酯(polycaprolactone,PCL)是最常用的组织工程材料之一,它的溶解性、可电纺性、生物相容性和可生物降解性能优异[30].本研究使用NCA开环聚合法制备了含聚肽链段的聚(炔丙基-L-谷氨酸酯)-block-聚环氧丙烷-block-聚(炔丙基-L-谷氨酸酯)(PPLG-PPO-PPLG)三嵌段共聚物; 将易成纤的PCL与PPLG-PPO-PPLG共混,制备了含聚肽链段的电纺纳米纤维; 接着用温和的Thiol-Yne光点击反应将氨基引入到纳米纤维表面,并采用傅里叶变换红外(FT-IR)光谱和X射线光电子能谱(XPS)对改性后的纤维表面进行了表征.
炔丙醇(纯度99%)、L-谷氨酸(纯度99%)、三光气(纯度99%)和巯基乙胺盐酸盐(cysteamine hydrochloride,CAH,纯度98%)均购自阿拉丁试剂公司.聚醚胺(amino-terminated polyoxypropylene,NH2-PPO-NH2,Mn=4 kg/mol,分子量分布指数(polydispersity index,PDI)=1.17)、PCL(Mn=50 kg/mol,PDI=1.12)和无水N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethyl formamide,DMF)均购自Sigma-Aldrich.乙酸乙酯和二氯甲烷(dichloromethane,DCM)购自广州化学试剂厂,使用前经分子筛干燥、重蒸后使用.光引发剂651(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone,DMPA)在甲醇中重结晶后使用.
1H-NMR在Varian 300 MHz 核磁共振仪上采集,测试小分子结构使用的溶剂有D2O和CDCl3,测试聚合物的结构时使用混合溶剂V(CDCl3):V(CF3COOD)=4:1.尺寸排除色谱(SEC)采用Waters高效凝胶色谱系统,折光指数探测器检测样品信号,以3根串联的聚苯乙烯柱子为固定相,以含0.1 mol/L LiBr的DMF溶液为流动相,温度50 ℃,流速1 mL/min.FT-IR光谱用Nicolet-6700型红外光谱仪采集,纳米纤维表面结构的分析使用衰减全反射(ATR)模式.XPS测试的仪器型号为Thermo Scientific ESCALab 250Xi,使用200 W的单色Al Kα照射,分析室真空度为3×10-8 Pa.纳米纤维的表面形貌采用Hitachi-S4800型扫描电镜(SEM)观察,电压15 kV,通过软件Image plus6分析纤维直径的分布,每个样品随机测量100处纤维的直径.热失重曲线由Netzsch-STA 449 F3 Jupiter采集,样品在空气氛围中测定,升温速度为10 ℃/min,温度范围为室温至800 ℃.纳米纤维由TL-01型静电纺丝仪(深圳通利威纳有限公司)制备.
PPLG-PPO-PPLG的制备
参考文献[9,31],过程如图1所示:1)丙炔醇与L-谷氨酸在强酸催化下发生酯化反应制备L-谷氨酸丙炔醇酯(propargul-L-glutamate,PLG); 2)将PLG悬浮在无水乙酸乙酯中回流,与三光气发生闭环反应制备L-谷氨酸丙炔醇酯-N-羧基环内酸酐(PLG-NCA); 3)用NH2-PPO-NH2在室温条件下引发PLG-NCA单体开环聚合,分子质量由单体和引发剂的摩尔比控制.
聚肽/PCL混纺纳米纤维的表面改性使用Thiol-Yne法.为验证Thiol-Yne表面改性的可能性,同时合成了侧链经CAH改性的PPLG-PPO-PPLG为模型聚合物,命名为PPLGgCAH-PPO-PPLGgCAH.Thiol-Yne光点击反应的操作过程是:将PPLG-PPO-PPLG(0.167 g)和CAH(0.284 g)溶于2.0 mL的DMF中,完全溶解后加入光引发剂DMPA(22.5 mg),用手电筒式伍德氏LED灯(λmax=365 nm)辐照10 min.反应后混合液在水中透析36 h(透析袋的截留分子质量为3.5 kg/mol),每隔4 h换一次水,所得的PPLGgCAH-PPO-PPLGgCAH冻干后为浅黄色粉末(产率63%).聚合物的合成和侧链改性过程如图1所示.
电纺纳米纤维的制备过程:首先,将一定量的PCL/PPLG-PPO-PPLG混合物溶解于DCM中,其中PCL的质量分数固定为6%,PPLG-PPO-PPLG的质量分数分别为0,1.5%,2.25%和3.0%.用一次性注射器吸取5 mL混合物溶液,在20 kV的电压下,以3 μm/min速度推进,纺丝针为9号针头.用平板接收器进行收集,针头与接收器的最近距离为15 cm,所有实验在室温条件下进行.
表面改性过程:将纳米纤维膜剪裁成1.5 cm×1.5 cm的薄片,浸泡于最少量乙醇中,使溶剂完全淹没膜表面.此时加入100 mg的CAH和5 mg的DMPA,30 min后用手电筒式伍德氏LED灯(λmax=365 nm)辐照10 min.用镊子收取薄膜,分批次用足量去离子水浸泡5次,每次30 min,再分批次用无水乙醇浸泡5次,每次30 min,晾干后用锡箔纸包裹,真空干燥.
为了研究用Thiol-Yne光点击反应对纳米纤维进行表面改性的可行性,首先制备了模型聚合物PPLGgCAH-PPO-PPLGgCAH.用1H-NMR确定了所制备的聚合物的结构,结果如图2所示.图2-a中指认了PPLG-PPO-PPLG中的各种质子峰,炔基旁边的亚甲基和主链次甲基上的质子(图2-a中的峰2和5)的化学位移分别为4.73和4.12,前者是验证Thiol-Yne光点击反应效率的特征峰.已知PPO的重复单元为70,因此根据峰2和PPO的甲基质子峰(峰8)的面积比,计算出三嵌段共聚物中PLG的重复单元为33,其数均分子质量为15 kg/mol.测定时加入的CF3COOD可以破坏聚肽的二级结构并增加溶解性,使质子信号不受主链僵硬构象的影响,所得结果更为准确.SEC法测得PPLG-PPO-PPLG的数均分子质量为23 kg/mol,PDI为1.25.接枝CAH后的产物PPLGgCAH-PPO-PPLGgCAH的1H-NMR如图2-b、c所示,分别以D2O和二甲基亚砜(d6-DMSO)为溶剂,同样指认了新生成的质子峰的化学位移.从图2-b可以看出,图中出现了几组新的质子峰(峰9~12).特别地,接枝后峰2的化学位移由原来的4.73转移到了4.25(峰2'),这表明CAH被接枝到聚肽侧链.为了消除D2O溶剂峰的影响,在以d6-DMSO为溶剂时,接枝后峰2完全消失(如图2-c中矩形虚线框处所示),这说明侧链的炔基被CAH完全消耗,转化率几乎为100%.在Thiol-Yne光点击反应中,炔基和巯基可以发生1:1和1:2加成,前者将形成碳碳双键.由图2-b、c可以看出,在δ 5.0~7.0之间并不能观察到碳碳双键上的质子信号峰,这说明侧链炔基和巯基以1:2的比例发生加成反应,因此侧链形成硫醚结构.从此模型聚合物的制备可以看出,Thiol-Yne光点击反应的效率极高、条件温和,这与文献[9]的研究结论一致,说明用Thiol-Yne光点击反应对纤维表面进行改性具备可行性.
a~c中使用的溶剂分别为V(CDCl3):V(CF3COOD)=4:1,D2O,d6-DMSO.
图2 PPLG-PPO-PPLG(a)和PPLGgCAH-PPO-PPLGgCAH(b,c)的1H-NMR谱图
Fig.2 1H-NMR spectra of PPLG-PPO-PPLG(a)and PPLGgCAH-PPO-PPLGgCAH(b,c)
采用SEM表征所制备的纯PCL纤维和聚肽/PCL共混纤维的形貌,如图3所示.在DCM中,质量分数为6%的PCL成纤性能很好,没有发生严重的非纤维状聚集.不过PCL纤维的直径较粗,为微米级.对于聚肽/PCL共混纤维,当聚肽的质量分数为1.5%和3.0%时,纤维上均有“串珠”状缠结,质量分数为3.0%时情况更严重,表明聚肽质量分数较大时不容易成纤.这是因为聚肽质量分数较大时,聚肽僵硬的主链使其在DCM中的溶解度下降,导致缠结现象的发生.不过,当聚肽的质量分数为2.25%时,成纤性能良好,纤维上没有“串珠”状缠结.可以看出,聚肽成分对纤维的影响很大,当有聚肽成分存在时,共混纤维的直径明显减小.这说明溶剂在挥发时,大分子链聚集态的方式和纯PCL相比有所变化.
图3 不同聚肽质量分数下聚肽/PCL共混电纺纳米纤维的SEM图
Fig.3 SEM images of electrospinning polypeptide/PCL blend nanofibers at different polypeptide mass fraction
聚肽质量分数为2.25%的共混物的成纤性能最好,因此以该组分的纳米纤维作为表面改性对象,在其表面接枝CAH分子,改性前后纳米纤维的SEM图如图4所示.从图中可以看出,经改性和多次浸泡后干燥处理的纤维表面状态并没有被破坏,与改性前相比基本没有发生变化,这表明制备的纤维稳定性很好,Thiol-Yne法改性对表面的影响也很温和.根据纤维的直径分布分析,改性前的平均直径为(550±135)nm,改性后的平均直径为(590±154)nm.直径增大的原因可能是改性后纤维膜表面由原来的疏水性变为亲水性,大分子链容易吸水而发生少许膨胀.
联合ATR-FT-IR和XPS对改性前后的纤维表面结构进行了分析.ATR-FT-IR的结果如图5所示,改性前聚肽组分的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的特征吸收峰分别位于1 650和1 549 cm-1,在2 127 cm-1处还可以看到侧链炔基的微弱吸收峰.在1 650和1 549 cm-1处的吸收峰表明聚肽链段呈典型的α-螺旋构象[32-33].α-螺旋构象是由聚肽的分子内氢键形成的,这种有序的二级结构会导致聚肽的主链僵硬,从而影响纳米纤维的形态和直径.改性后纤维表面的ATR-FT-IR谱图变化不大,只是炔基的吸收峰显著减弱,表明纤维表面部分炔基发生反应,但聚肽仍呈α-螺旋构象.α-螺旋构象导致聚肽主链较硬,但PCL分子链的柔顺性很好.结合图3中纳米纤维的尺寸分析,说明α-螺旋构象对纤维的直径起到决定性影响,柔顺性低的大分子链倾向于形成尺度更小的纤维,而柔顺性高的大分子链倾向于形成尺寸更大的纤维.
图5 聚肽/PCL共混电纺纳米纤维表面在改性前后的ATR-FT-IR谱图
Fig.5 ATR-FT-IR spectra of the electrospinning polypeptide/PCL blend nanofibers before and after the surface modification
图6 聚肽/PCL共混电纺纳米纤维表面改性前后的XPS图
Fig.6 XPS of the electrospinning polypeptide/PCL blend nanofibers before and after the surface modification
FT-IR的灵敏度不足以揭示纤维的表面结构,因此用XPS进一步分析,结果如图6所示.图6(a)显示,与改性前相比,改性后纤维膜表面出现了S-2p和Cl-2p的特征峰,这说明纤维膜表面除了含有改性前的C、O、N元素之外,还含有来源于CAH分子的S和Cl元素.CAH中的N和主链酰胺键中N的化学环境不同,如图6(b)所示,改性前只有位于399.8 mV处的酰胺键上N元素的特征峰,改性后又在398.5 mV处出现了新的N原子峰,这充分说明了CAH分子被接枝到纳米纤维膜的表面.
用热重分析进一步研究了PPLG-PPO-PPLG在空气中的热稳定性,结果如图7所示.PPLG-PPO-PPLG在空气中受热时,温度超过200 ℃开始发生分子链降解.在200~400 ℃范围内降解速率较快,此后变慢,超过650 ℃完全降解.
本研究通过将含有聚肽链段的共聚物与PCL共混后进行电纺,制备了聚肽/PCL共混纳米纤维.聚肽组分的引入极大地改变了电纺纤维的直径和形态,聚肽含量越大,影响就越大,这种影响源自于聚肽的α-螺旋构象.使用Thiol-Yne光点击表面改性技术可以在纤维表面引入氨基阳离子,即使经过多次后处理,纤维的形貌也没有被破坏,这说明所制备的纤维的稳定性很好; 而且Thiol-Yne技术对纤维表面的影响也很温和,对纳米纤维无损伤,且该方法简单易行.