(College of Materials,Xiamen University,Xiamen 361005,China)
viscometric method; intrinsic viscosity; bovine serum albumin(BSA); conformation
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201608005
备注
采用乌氏黏度计测定不同pH条件下牛血清白蛋白(BSA)的黏度,运用Wolf方程描述BSA的黏度变化行为.详细讨论了不同pH条件下BSA的特性黏数(intrinsic viscosity,[η])与其构象的关系,并分析了BSA比特性黏数(specific intrinsic viscosity,{η})的组成变化.研究结果表明,采用这种新型的黏度法研究球状蛋白质的构象或溶液性质是科学、可行的.
The viscosities of bovine serum albuminin(BSA)in different pH buffers were measured using Ubbelohde capillary viscometer,and the data were evaluated by Wolf equation to describe the composition dependences of BSA.The intrinsic viscosities([η])of BSA under different pH were correlated with its conformation,and the composition dependences of specific intrinsic viscosities({η})of BSA were carefully analyzed.Our results indicate that the new viscometric method can be applied in the study of conformation and solution properties of spherical protein.
引言
牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)是由牛肝脏细胞分泌的蛋白质,约占血清蛋白质总质量的一半,是由583个氨基酸残基通过脱水缩合形成的多肽链[1].BSA的结构功能与人血清白蛋白相似,且来源丰富、性质稳定、成本较低,因而在食品、保健、生物医药等领域得到广泛应用.但是,上述应用的实现多依赖于BSA特定的分子构象,它受体系及其温度、盐度和pH等因素的影响.因此,研究BSA的分子构象具有十分重要的理论价值,也是揭示其生理功能奥秘的重要途径.迄今,科学家们多采用光谱法来研究BSA的构象,通常认为其为近似“心形”的球状分子[1-3],其肽链含有大量游离的带电羧基端和氨基端,水溶性好且能电离,相当于一种较弱的两性高分子电解质.
黏度法作为高分子表征的最基本方法之一,常用来研究链状高分子的构象变化.采用传统经验方法如Huggins方程或Fuoss-Straus方程,通过外推至无限稀释获得截距而求得特性黏数(intrinsic viscosity,[η]).但是,这类传统方法使用0/0型外推,在分子、分母都趋于0的外推过程中,难以避免极低浓度下实验过程中的不确定因素带来的巨大误差[4-5].对于聚电解质而言,由于分子链中带电基团的静电排斥作用,导致上述传统方法在较低浓度范围不再满足线性关系[4-6],这给确定聚电解质的特性黏数带来了困难.针对该难点,Wolf[7]提出由lnηrel-c曲线的起始斜率来确定聚电解质的特性黏数,该方法不需要对聚电解质溶液黏度和浓度间的关系进行假设,避免了传统方法中实验误差的放大,是一种具有普适性的确定链状高分子特性黏数的新方法.但是,这种方法对球形构象的高分子或电解质是否适用则还未通过验证.因此,本研究运用Wolf方程来描述BSA在不同pH缓冲溶液中的黏度行为并分析其溶液性质,期望由此建立蛋白质构象研究的简便方法.
1 实验部分
1.1 原料与试剂BSA(第五组分,生物试剂,纯度98%)采购自广州蕊特生物科技有限公司; CH3COOH、CH3COONa、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2CO3、NaHCO3均为分析纯,采购自西陇化工股份有限公司; 实验中所用的水为去离子水.
1.2 BSA溶液黏度测定配制具有不同pH的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液(pH=3.8,4.6,6.0)、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH=6.7,8.4)和NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液(pH=10.1,11.5).分别以这些溶液为溶剂,室温溶解BSA,配制质量浓度约为4 g/L的BSA溶液.在(30.0 ± 0.1)℃的恒温水浴中,采用毛细管直径为0.47 mm的乌式黏度计,通过逐步稀释法测定上述BSA溶液的黏度.
2 理论分析
在特定温度和溶剂中,高分子的特性黏数定义[6]为
[η]≡limc→0(lnηrel)/c≡limc→0(ηsp)/c,(1)
其中:相对黏度ηrel为高分子溶液黏度η和纯溶剂黏度η0的比值,即为η/η0; 增比黏度ηsp为高分子溶液相比于纯溶剂黏度的相对增加量,即ηsp=(η-η0)/η0=ηrel-1.根据式(1),将(lnηrel)/(c)或(ηsp)/(c)外推到浓度为0(c→0)的截距值,即为高分子的特性黏数[η].Wolf[7]通过唯象原理结合热力学状态方程,获得dlnη表达式为
dlnη=((lnη)/(c))T,p,(·overγ)dc+((lnη)/(T))c,p,(·overγ)dT+
((lnη)/(p))c,T,(·overγ)dp+((lnη)/((·overγ)))c,T,pd(·overγ),(2)
其中,等式右边第一项代表一定浓度c的高分子溶液在规定条件(温度T、压力p和剪切速率(·overγ))下的特定流体力学体积,定义为任意浓度高分子溶液的比特性黏数(specific intrinsic viscosity,{η}):
((lnη)/(c))T,p,(·overγ)={η}.(3)
根据[η]的定义(式(1)),在零剪切且无限稀释条件下,高分子溶液的比特性黏数即是特性黏数:
limc→0(·overγ)→0{η}=[η].(4)
由此,以实验数据lnη(或lnηrel)对c作图,曲线的起始斜率即是[η].这表明可通过定量描述高分子溶液的黏度与浓度的变化关系来直接获得[η].通过大量实验,已建立了一些描述高分子溶液黏度与浓度变化的经验方程,如Huggins方程和Kraemer方程[6]:
(ηsp)/c=[η]+kH[η]2c,(5)
(lnηrel)/c=[η]-β[η]2c,(6)
式中kH 和β分别为Huggins常数和Kraemer常数.这些方程在稀溶液范围,甚至是高度稀释下的(lnηrel)/c或(ηsp)/c与浓度c之间满足线性关系,由此成功获得不带电高分子的特性黏数.然而,在高度稀释(浓度极小)情况下,即c和lnηrel(或ηsp)趋于0时,不可避免的实验误差将导致这种0/0型的外推带来特性黏数的巨大误差[4,7].另外,聚电解质在溶剂中电离后,相同电荷的静电排斥作用会引起分子链的扩展,导致上述传统方程不能描述聚电解质黏度随浓度的变化.由此,Fuoss和Strauss[6]根据经验提出了另一个经验方程
((ηsp)/c)-1=[η]-1(1+kFSc1/2),(7)
式中kFS为相应常数.但该方程也涉及0/0型外推以及由此引起的误差,并发现其并不具备普适性[4,7].
Wolf[7]假定,在高分子浓度提高到聚电解质分子链的反荷离子(counter ion)或在外加盐离子足够屏蔽聚电解质分子链上的静电排斥效应时,聚电解质的流体力学体积(即比特性黏数)将从无限稀释情况下的[η]以指数形式降低至一个常数[η]±,该变化的聚合物浓度范围为A,即
{η}=([η]-[η]±)e-(([η]-[η]±)c)/A+[η]±,(8)
该方程也可改写为
{η}=[η](pe-(pc[η])/A+(1-p)),(9)
其中,p=(([η]-[η]±)/([η])).经积分后为
lnηrel=A(1-e-(pc[η])/A)+(1-p)c[η].(10)
类似地,将Huggins方程(式(5))积分后,得到
lnηrel=(c[η]+Bc2[η][η]·)/(1+Bc[η]),(11)
式中,B代表一个无量纲的黏度相互作用参数,[η]·则是与 [η]±相似的量.式(10)和(11)已用于准确描述多种聚电解质溶液的黏度-浓度变化关系[4,7-17].
值得指出的是,聚电解质往往处于各种额外盐离子共存的溶液中,且外加盐离子价态各异.近期发现,式(12)能普适于聚电解质共存于各价态外加盐离子的溶液[8]:
lnηrel=((~overc))/(1+p(~overc)+q(~overc)2),(12)
其中,(~overc)=c[η]为高分子缩约浓度(reduced polymer concentration),q为聚电解质加入后引起的溶液自由体积的变化.因此,采用式(12)描述本工作中BSA在各种缓冲溶液中的黏度-浓度变化关系.
3 结果与讨论
以实验数据中相对黏度的对数对浓度作图,结果如图1所示.将数据点用式(12)拟合,得到各pH条件下的lnηrel-c曲线和相应参数(表1).在pH=3.8,6.0,6.7,8.4和10.1的缓冲溶液中,相应数据点均可被式(12)准确拟合,其拟合回归系数(regression correlation coefficient,R2)均接近1.需要提及的是,在pH为4.6和11.5的缓冲溶液中,相应数据点采用式(12)拟合时误差较大,这可能是由于处在BSA等电点(pI=4.7)附近时,BSA分子几乎呈电中性、紧缩而易于沉降,而在强碱性(pH=11.5)下BSA分子已发生降解、二级结构变化等所致,所以在这两个pH条件下体系可能处于非热力学平衡状态.
表1 不同pH缓冲溶液中BSA溶液的lnηrel-c拟合相关参数
Tab.1 Parameters for calculations of the lnηrel-c for BSA in different pH buffers图1 不同pH缓冲溶液中BSA的lnηrel与浓度的关系
Fig.1 Relationship between lnηrel and concentration for BSA in different pH buffers表1显示了BSA特性黏数随pH的变化关系,即在pH=3.8时特性黏数较低,随pH升高(6.0,6.7)特性黏数增大,进一步升高pH(8.4,10.1)特性黏数减小.该结果与文献[18-19]报道的一致,反映了BSA分子构象随pH的变化.BSA是两性聚电解质,含有的氨基酸种类和数量较多,且存在支链,溶解时大量末端氨基(—NH2)和羧基(—COOH)暴露于溶剂中.BSA在水中的离解过程[18-20]可看作
HOOC-B-NH+3〖FY(KN〗OH- H+〖FY)〗-OOC-B-NH+3〖FY(KN〗OH- H+〖FY)〗
-OOC-B-NH2.(13)
因此,在pH低于或者高于BSA等电点时,BSA相应离解成BSA+和BSA-.据报道,BSA的分子会随pH变化而呈现5种构象[20]:pH低于2.7时的完全酸膨胀构象(acid expanded conformation,E构象)、pH介于2.7~4.3时的部分酸膨胀构象(partially acid expanded conformation,F构象)、pH介于4.3~8.0时的正常构象(native conformation,N构象)、pH介于8~10时的碱化构象(basic conformation,B构象)和pH高于10时的陈化构象(aged conformation,A构象).
如表1所示:在pH=4.6时,由于接近BSA的等电点,溶液整体几乎呈电中性,此时BSA在溶液中处于紧缩状态,分子间易于碰撞、缠结甚至沉淀析出,特性黏数最低; 在pH=3.8时,部分H+进入BSA分子空隙中形成BSA+,使分子内侧疏水残基开始暴露、结构松散而处于部分膨胀的快速翻转F构象状态,特性黏数升高; 在高于等电点的近中性缓冲溶液(pH=6.0,6.7)中,BSA主要离解成BSA-,表面基团间的静电排斥使分子链伸展而呈现N构象,特性黏数几乎达到最高; 将pH继续提高至8.4和10.1时,BSA分子表面的负电荷量进一步增加促使分子链继续扩展,但由于OH-的离子半径较大而难以进入BSA分子内部且体系离子强度提高而屏蔽静电排斥作用,BSA分子体积反而较近中性时有所降低,因此BSA的特性黏数亦有所减小而呈现B构象; 在强碱性缓冲溶液(pH=11.5)中,部分BSA可能发生二硫键的断裂而生成小分子,BSA特性黏数下降,呈现A构象.
另外,式(12)可变换为
({η})/([η])=(1-q(~overc)2)/((1+p(~overc)+q(~overc)2)2).(14)
通过该式可计算任意浓度下高分子的{η}(或者{η}/[η])随高分子缩约浓度(~overc)(或浓度c,(~overc)=c[η])的变化关系.图2显示了BSA在各pH条件下{η}/[η]与浓度的关系.该图最为显著的特征在于,在pH=3.8,6.0,6.7,8.4和10.1时,BSA的{η}/[η]-c的关系曲线位于{η}=[η]线的下方,但在pH=4.6和11.5时则位于{η}=[η]线的上方.位于{η}=[η]线下方的关系曲线显示,{η}/[η]随浓度升高而逐渐降低,说明BSA分子的{η}/[η]在这些pH条件下随浓度增高而降低,符合一般性聚电解质分子的热力学变化行为[10,14,17]; 这是因为随聚电解质浓度升高,对离子(和/或外加盐离子)浓度相应提升而屏蔽了聚电解质分子链上的静电排斥作用,使分子链收缩、体积减小.然而,在溶液pH接近BSA等电点(pH=4.6)或在强碱溶剂(pH=11.5)中,由本文中的方法计算得到BSA分子的{η}/[η]随浓度增加而升高; 在本研究的稀浓度范围(远低于分子交叠浓度),BSA分子几乎处于单个线团状态,因此上述情况可理解为BSA处于非热力学平衡状态而易于缠结甚至沉析或发生不可逆结构变化所致.
4 结 论
本研究运用Wolf方程成功地描述了BSA在不同pH缓冲溶液中的黏度行为,由此得到BSA的特性黏数[η],反映了BSA在不同pH条件下的构象与文献结果一致.应用Wolf方程,还可分析BSA的比特性黏数与浓度的关系,即BSA在等电点或强碱性中易处于非热力学平衡状态,而在其他条件下则表现出一般聚电解质的黏度行为.因此,可以采用这种新型的黏度法研究球形蛋白分子的构象或溶液性质.
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