人肝癌Huh7.5.1细胞使用添加了100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素、10%(体积分数,下同)胎牛血清(FBS)、0.1 mmol/L非必需氨基酸的DMEM完全培养基^[5],于37 ℃、5%(体积分数,下同)CO₂的细胞培养箱中培养.HCV病毒株为使用Huh7.5.1细胞体外培养的HCV-JFH-1株,由厦门大学附属中山医院惠赠.

HCV核心区重组蛋白DPC173与弗氏佐剂(Sigma-Aldrich公司)混合免疫BALB/c小鼠3次后,检测小鼠血清抗体滴度达到10⁶,取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用添加了氨基蝶呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶的含10% FBS的RPMI1640培养基(Gibco公司)筛选,获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞.将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,一周左右收集小鼠腹水,使用蛋白A柱(GE公司)纯化得到针对HCV核心区的鼠源单抗17H11^[6].

为确定17H11的具体作用表位,HCV核心区共合成18条多肽,每条多肽和相邻的多肽有10个左右重叠的氨基酸^[7],分别是核心区氨基酸序列第1～19位、11～31位、21～40位、31～50位、41～60位、51～70位、61～80位、71～91位、81～100位、92～109位、101～120位、111～130位、121～138位、131～150位、139～160位、151～170位、161～180位、171～191位,由上海生工生物工程股份有限公司合成.

将用磷酸盐缓冲液(PBS)梯度稀释成1 000,100,10,1,0.1 ng/μL的HCV重组抗原DPC173、超声处理后的细胞培养的HCV病毒株(HCVcc)、未处理的HCVcc及PBS各取1 μL点渍于硝酸纤维素膜方格内,置于干燥间干燥2 h后,用封闭液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl,2%(质量分数,下同)牛血清白蛋白(BSA),0.5%(质量分数)酪蛋白,0.1%(体积分数,下同)Tween 20)37 ℃封闭1 h; 17H11单抗用PBS稀释成10 μg/mL加入10 mL于平皿中37 ℃孵育1 h,洗涤3次后,加入用稀释液1(20%(体积分数)山羊血清,400 mmol/L pH 7.4 PBS,40%(质量分数)蔗糖,10%(质量分数)酪蛋白)按1:5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(GAM-HRP,购自美国Sigma公司)二抗,37 ℃反应50 min; 洗涤3次后,用四甲基联苯胺(TMB)显色^[8].

抗体表位

合成的各区段多肽用PBS稀释成1 mg/mL,用20 mmol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释成0.5 μg/mL,每孔100 μL加至96孔板,37 ℃放置2 h; 洗板1次后甩干,每孔加200 μL封闭液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl,2%BSA,0.5% 酪蛋白,0.1% Tween 20),37 ℃放置2 h后甩干; 17H11单抗用PBS稀释成10 μg/mL,每孔100 μL与各区段包被的ELISA板37 ℃反应40 min; 洗板5次后,加入用稀释液1按1:5 000稀释的GAM-HRP二抗,37 ℃反应30 min; 洗板5次,显色,读取450 nm下的吸光度(OD₄₅₀)值^[7].

取1 mg生物素溶解于1 mL PBS,抗体与生物素(购自美国Sigma公司)按摩尔比1:20的比例混合,室温下放置1 h后转移至透析袋中,于4 ℃ PBS中透析6 h,中间换液3次,取出透析袋,将标记好的17H11抗体分装至EP管中,-20 ℃保存.

观察100 mm细胞培养盘中Huh7.5.1细胞生长到95%汇合率时,使用1 mL胰酶消化细胞,按每孔1×10⁵个铺至96孔细胞培养板,于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱培养12 h.将初始感染性滴度7×10⁴ PFU(空斑形成单位)/mL的HCVcc病毒按照1:10梯度稀释后感染96孔板中的Huh7.5.1细胞,感染后36 h,吸掉培养基及病毒,PBS洗板1次后每孔加入50 μL -20 ℃冰浴的100%甲醇,-20 ℃放置15 min对细胞进行固定及通透.PBS洗板2次,每孔加入100 μL封闭液(1%BSA,0.25 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA))后置于37 ℃培养箱中封闭1 h; 洗板1次,每孔加入17H11或生物素标记的17H11 100 μL,37 ℃孵育1 h; 洗板5次后,加入GAM-HRP或辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自美国Sigma公司)100 μL,37 ℃孵育40 min; 洗板5次后,显色,读板^[9].

评价HCV病人血清中和作用

100 mm细胞培养盘中细胞生长到95%汇合率后,用胰酶消化,按每孔1×10⁵个细胞铺至96孔细胞培养板,放置于5% CO₂的细胞培养箱培养.待细胞生长到90%汇合率后,将按2倍梯度稀释好的人血清(血清稀释倍数为0～2¹¹)与HCVcc病毒混匀后于37 ℃孵育1 h; 将孵育后的病毒感染Huh7.5.1细胞,感染后36 h使用ELISPOT平台检测细胞内的HCVcc复制情况.比色法自动计数平台(colorimetric focus-forming assay)细胞培养、血清稀释、病毒感染、固定、封闭、读板及分析与本平台相同,但比色法用针对HCV核心区鼠源IgG1抗体(购自Thermo公司)1:1 000稀释作为一抗,以碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(GAM-AP)为二抗,用5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝(BCIP/NBT)显色^[9].

为确定17H11与丙肝核心抗原的反应特应性,运用DIBA分别验证17H11与梯度稀释的HCV核心区重组蛋白DPC173及处理前后HCVcc的反应性,同时设置PBS作为阴性对照.如图1所示:HCV核心区重组抗原在DPC173蛋白质量浓度为1 000,100,10 ng/μL时与17H11有明显反应,1 ng/μL时有微弱反应,与PBS无反应.HCVcc在未处理的情况下与17H11无反应,究其原因,HCV病毒颗粒外有包膜蛋白包裹,未经处理的HCVcc核心区不能暴露; 而经过超声处理后核心区暴露,便可与17H11有明显抗原抗体反应.由此可知,17H11与重组抗原反应质量浓度下限约为10 ng/μL,可与HCVcc核心区有特异反应.

图1 DIBA检测17H11反应性
Fig.1 The reactivity of 17H11 by DIBA

如图2所示,通过ELISA间接法,将17H11分别与HCV核心抗原不同区段的肽段反应,17H11只与31～50区段多肽有强反应,可推测17H11作用的表位在HCV核心抗原的第31～50位氨基酸内.

图2 17H11单抗表位鉴定
Fig.2 Epitope identification of 17H11

首先以17H11(0.5 μg/mL)为一抗,用GAM-HRP按1:5 000稀释为二抗,确定最佳的抗体稀释液.本研究共选择3种稀释液进行测试,分别是稀释液2(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl,20% FBS,1%酪蛋白,10%蔗糖)、稀释液3(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,0.05% Tween 20,30% FBS,5 mmol/L CaCl₂)和稀释液4(1 mol/L pH 7.85 Tris-HCl,20% FBS,10%酪蛋白,10%蔗糖).由图3可知:使用稀释液2作为抗体稀释液时,HCVcc病毒感染的孔中形成的斑点清晰(图3(a)),而无病毒感染的阴性对照孔中没有斑点形成且背景比较干净(图3(d)); 使用稀释液3和4进行ELISPOT检测时,HCVcc感染可检测到清晰斑点,但背景稍高(图3(b)和(c)),无病毒感染的阴性对照孔也能检测到斑点(图3(e)和(f)),存在背景本底过高的问题; 而稀释液2中的蔗糖可以有效地保持抗原的活性,FBS及酪蛋白可以起到降低非特异性反应的作用,又在一个较好的pH环境下有效地避免了稀释液3和4的问题.因此,最终确定使用稀释液2作为后续实验的抗体稀释液.

图3 使用不同稀释液ELISPOT检测HCVcc
Fig.3 HCVcc detection by ELISOPT using different diluents

为了进一步确定ELISPOT使用的最佳抗体浓度,分别使用不同质量浓度的一抗17H11(0.25,0.5,1,2 μg/mL)和不同稀释倍数的GAM-HRP(1:3 000,1:4 000,1:5 000,1:6 000)为条件进行ELISPOT实验,结果如图4所示:当17H11质量浓度为0.25 μg/mL,二抗稀释倍数为1:5 000时,HCVcc感染的孔中形成的斑点清晰,且无病毒感染的阴性对照孔没有假阳性的斑点形成,背景干净.因此,确定了一抗17H11质量浓度0.25 μg/mL、二抗稀释倍数1:5 000为反应条件,可实现ELISPOT对HCVcc的检测.

左上角数值代表斑点数.

图4 一抗17H11及二抗GAM-HRP质量浓度的确定
Fig.4 Determination of concentrations of first antibody 17H11 and secondary antibody GAM-HRP

小鼠是疫苗免疫最常用的动物,上述平台由于使用GAM-HRP作为二抗,不能用于小鼠血清中和抗体的检测.对此曾尝试17H11直接标记HRP,通过一步法检测HCVcc,但是存在很严重的非特异性反应(实验结果未展示).因此尝试将17H11标记生物素,使用GAM-HRP标记的链霉素作为二抗,通过链霉亲合素-生物素放大系统,实现HCVcc的检测.按照上述相同的方法,经过对稀释液、一抗及二抗浓度的摸索,最终确定检测条件如下:一抗使用标记生物素的17H11(1 mg/mL),稀释液1稀释4万倍使用; 二抗为SA-HRP(1 mg/mL),稀释液2稀释1万倍使用.由图5可以看出,经过调试后的中和抗体检测平台可实现阴阳性分开,并以此条件作为ELISPOT检测HCV中和抗体的反应条件.

图5 ELISPOT中和抗体检测平台阴阳性对比
Fig.5 Detection of HCVcc and mock infection by ELISPOT platform

自动计数平台对HCV病人抗体阳性血

清中和效果评价

为了验证建立的平台是否能够检测HCV中和抗体,选取6份不同型别HCV病人的血清标本及2份正常人血清标本,病人血清编号及HCV型别为M256(2a)、M412(2a)、M107(1b)、M389(1b)、M115(3a)、M029(6a),正常人血清编号为N126和N124.经HCV抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)检测,6份病人血清抗体呈阳性且检测值分别为3.845,2.046,3.546,1.178,2.227和1.463,2份正常人血清检测值为0.012和0.010.将血清梯度稀释后与病毒混合,感染Huh7.5.1细胞36 h后,分别用比色法自动计数平台及本研究建立的平台进行ELISPOT检测,每份血清样本做4组重复.如图6所示,对2种方法的计数点进行对比,r²值为0.930 6,p<0.000 1,说明本平台与已报道的方法得出结果有显著相关性,所得数据可靠.

图6 比色法自动计数平台与ELISPOT平台对比
Fig.6 Comparison of colorimetric focus-forming assay with ELISPOT platform

对本平台得出的中和效果进行评价,由图7可知:计数点随6份HCV病人血清的稀释倍数(0～2¹¹倍)增加而增加,而正常人血清不同的稀释倍数下计数点没有明显的变化,说明此6份HCV病人血清均具有对JFH-1(2a)病毒的中和作用; 而对2a型外的M107(1b)、M389(1b)、M115(3a)、M029(6a)标本同样有一定的中和作用,说明不同型别的HCV病人血清中存在广谱抗体; 此外,抗体水平最高的M256(2a)和M107(1b)中和效果最强.由于现阶段不同型别的HCV病人血清标本较少,抗体水平、型别与中和作用的关系仍需进一步验证.上述实验结果说明,本研究建立的中和抗体检测平台,可广泛应用于疫苗的评价和HCV病毒的入胞机制等基础研究.

图7 血清中和作用评价
Fig.7 The neutralization effect of human sera