(College of Ocean & Earth Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)
astaxanthin; Haematococcus pluvialis; industrialization; photobioreactors
DOI: 10.6043/j.issn.0438-0479.201606101
作为一种重要的类胡萝卜素,天然虾青素因其强抗氧化能力而具有抗癌、增强免疫、抗紫外线、着色等功效,故具有很高的经济价值和市场需求.雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)被公认为天然虾青素的最佳来源,现已成功实现规模化培养.另一方面,由于其生长缓慢、易受污染等特点使其大规模高密度培养受到限制,该领域研究遂成为当前国际研究和生产方面的重要课题.目前,雨生红球藻规模化培养技术主要分为开放式和封闭式两类,后者主要包括管道式光生物反应器、立柱式光生物反应器、平板式光生物反应器、薄膜式光生物反应器以及半球体式光生物反应器等培养技术.归纳和总结了目前全球雨生红球藻产业化培养的技术现状,并对新的培养技术做了简单的介绍,以期为我国雨生红球藻规模化养殖提供技术参考.
As an important carotenoid,natural astaxanthin has anti-cancer,enhancing immunity,anti-UV,coloring and other effects as a result of its strong antioxidant ability,so it has a high economic value and market demand.Haematococcus pluvialis is considered the best source of natural astaxanthin and now it has successfully achieved largescale cultivation.On the other hand,its growth is slow,vulnerable to pollution so as to make large-scale high-density culture limited.The research in this area is becoming an important subject of international research and production.Currently,H. pluvialis cultivation technology is divided into two categories,open and closed,with the latter including tubular photobioreactor,bubble column photobioreactor,flat panel photobioreactor,thin-film photobioreactor and hemispheric photobioreactor culture techniques.Through literature research,we summarized the current state of the global H. pluvialis industrial culture technology and did a brief introduction to a new culture technology,in order to provide a technical reference for scale farming of H. pluvialis in our country.
虾青素(astaxanthin)是叶黄素家族中的一员,呈鲜红色,广泛存在于自然界中,如植物的叶子、果实中,鱼、虾、蟹等动物的体内,还有一些微型藻类、真菌以及鸟类(如火烈鸟)的羽毛中等[1].在海洋环境中,虾青素最初由微型藻类或浮游植物在体内合成,再由浮游动物或甲壳动物通过摄食微藻在其体内积累虾青素,然后再由更高营养级的鱼类通过摄食作用,在食物链中进行虾青素的积累和传递[2-3].
虾青素是一些鲑鱼、甲壳动物和其他养殖鱼类饲料中的主要色素,主要作用是为这些生物体提供理想的体色,从而提高这些产品的品质和经济价值[4-5].除了着色功能以外,虾青素独特的分子结构赋予了其强大的抗氧化性.据报道,虾青素的抗氧化活性是维生素E的550倍,是β类胡萝卜素的10倍[6],在抗炎[7]、预防和治疗眼睛疲劳[8]、保护脑中枢系统[9]、防皱抗衰老、增强体质、提高身体免疫力[10]、预防和治疗心脑血管疾病[11]、保护和提高人体免疫系统以及预防癌症和减小肿瘤[12]等方面具有良好的生理治疗效果.我国在2010年10月29日由国家卫生计生委食品安全标准与检测评估司发布的2010年第17号文件(http:∥www.nhfpc.gov.cn/sps/),正式批准雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)成为我国的新资源食品.
虾青素市场需求巨大,在2000年,纯天然虾青素的价格已达到每千克3 500美元[2]; 到2010年,全球虾青素市场规模达到2亿3 000万美元以上[13]; 而在最近全球虾青素市场报告[14]中提到,在2014年,全球虾青素市场规模约为4.47亿美元,根据该报告,到2020年,全球虾青素市场规模将达到11亿美元的规模.目前,虾青素在食品添加剂、农业、水产养殖、保健、医疗、化妆品等行业的市场前景非常广阔.
市场上的虾青素来源主要分为4种:1)人工合成; 2)从甲壳动物中提取; 3)红发夫酵母(Phaffia rhodozma)提取; 4)藻类提取[5].从生物活性来看,人工合成虾青素的活性远不如天然虾青素高,并且在氧自由基清除方面,天然虾青素的活性是人工合成虾青素的20～30倍[15]; 此外,人工合成虾青素以游离态的形式存在而不像天然虾青素以酯化形式存在,因此在应用效果和生物安全方面要差很多.尽管天然虾青素的来源途径多样,但在所有报道的来源中,雨生红球藻被认为是自然界中虾青素含量最高的生物[16],其虾青素含量可以达到自身干质量的4%以上[17-19],是天然虾青素最好的来源.目前,全球很多国家和地区(见表1)已经成功实现了利用雨生红球藻生产天然虾青素.
表1 全球主要的雨生红球藻生产厂家及其核心技术
Tab.1 The main company of H. pluvialis cultivation in the world and their core technology
雨生红球藻是一种单细胞绿藻,分布广泛,普遍存在于临时性水体里,例如雨后比较浅的小水坑中,海边浸满水的小石坑里等[27]. Proctor[28]解释了雨生红球藻普遍存在于临时性水体而非永久性水体的原因,主要是由于生活在这些临时性水体中的藻类通常是自由竞争的,而这些水体也无任何固有特性,因此雨生红球藻因具有快速形成胞囊的能力,比大多数藻类更适合生存在这种强光照、高温和高盐的环境下.
在雨生红球藻的生活史中主要存在4种类型的细胞,如图1所示,包括鞭毛细胞、绿色球状细胞、中间细胞以及红色的胞囊[29].雨生红球藻具有特殊的生物学特性,即在有利的环境下,如弱光、温度适宜、营养盐充足等条件下,细胞主要以绿色的游动细胞存在,并健康生长; 而在不利的环境下,如强光、高盐度、高温、营养盐(氮、磷等)缺乏等条件下,游动细胞逐渐发展成为不动细胞,并形成厚的坚硬的细胞壁,同时在细胞内积累虾青素[30].值得注意的是,一些雨生红球藻的游动细胞在没有形成不动孢子时也能积累虾青素[31-32].雨生红球藻细胞内虾青素的积累被认为是细胞对外界不利环境胁迫的抵抗,是维持细胞生存的一种保护措施[33].
![图1 雨生红球藻的生活史[29]<br/>Fig.1 The life history of H. pluvialis[29]](2016年05期/pic76.jpg)
图1 雨生红球藻的生活史[29]
Fig.1 The life history of H. pluvialis[29]
根据雨生红球藻特殊的生物学特性,目前规模化培养和生产雨生红球藻的方法主要有“两步法(two stage)”和“一步法(one stage)”.
“两步法”主要是针对雨生红球藻在生长过程中呈现出的“绿色(green stage)”最佳生长和“红色(red stage)”虾青素积累两个不同阶段的特点所采用的生产方法[34-35],即在第一阶段中,通过提供最优的培养环境和培养条件,包括营养盐充足的培养基、最优的温度、光照以及pH等,以获取大量具有快速繁殖和生长能力的健康的“绿色”营养细胞,增加生物量浓度,这一阶段通常在室内进行.当“绿色”细胞生物量浓度达到一定程度后,将细胞转移至户外开放池或封闭式光生物反应器中进行第二阶段——“红色”虾青素积累的培养,使“绿色”细胞在诱导的条件下进行虾青素的合成和积累[2,36-37].值得注意的是,在“绿色”生长阶段,必须进行仔细的监测和控制,以免培养过程中出现污染和细胞的大量破碎死亡,从而影响“红色”诱导阶段的顺利进行[37].“一步法”是在连续培养模式[38]的基础上提出的,即雨生红球藻“绿色”和“红色”两个阶段在同一个光生物反应器中进行,通过对培养基中主要营养盐(如氮、磷等)和外部环境(如光照、温度等)的调节和控制实现“绿色”营养细胞到“红色”孢子的转换,既完成对“绿色”细胞生物量的大量增加,又实现这些细胞对虾青素的累积[34,39-40].
尽管“一步法”相较于“两步法”是一种连续培养模式,在操作和防止污染上有一定的优势,但在实际商业生产中很少有企业采用“一步法”进行商业生产.目前,在“一步法”培养过程中,雨生红球藻的虾青素单位产率较低,仅为5.6 mg/(L·d)[39],而用“两步法”培养的雨生红球藻的虾青素单位产率是其2倍以上[34],这很可能是大多数企业采用“两步法”生产雨生红球藻的主要原因.此外,Aflalo等[34]认为,由于“一步法”培养需要持续光照,因此该方法不太适合户外条件下的大规模生产,但这个观点也遭到了一些学者的质疑[40-41].
目前,在微藻规模化生产中存在各种各样的培养系统,这些培养系统大致可分为两种类型:开放式培养系统和封闭式培养系统.开放式培养系统又被称为跑道池或开放池,封闭式培养系统则包括管道式光生物反应器、立柱式光生物反应器、平板式光生物反应器、薄膜式光生物反应器以及半球体式光生物反应器等.表2列出了开放式培养系统与封闭式培养系统的主要区别.
对于雨生红球藻大规模养殖来说,这些培养体系中并没有一个系统在各个方面都明显优于其他培养系统.封闭式培养系统是一种相对较新的技术,预计未来将继续朝着更高效、更经济的趋势发展[43].这里根据雨生红球藻实际生产中常使用的培养技术进行介绍.
开放式培养系统主要为开放池(圆形)或跑道池,是最简单、最普通的微藻培养系统.目前,在雨生红球藻开放式培养体系生产中,主要以跑道池为主.跑道池
![表2 微藻开放式和封闭式大体积培养系统的比较[42]<br/>Tab.2 Comparison of open and closed large-scale culture systems for microalgae[42]](2016年05期/pic77.jpg)
表2 微藻开放式和封闭式大体积培养系统的比较[42]
Tab.2 Comparison of open and closed large-scale culture systems for microalgae[42]
的跑道深度一般为15～30 cm,长度和宽度可根据培养需要自行设计,培养液的流速大约为20～30 cm/s,通常用水车式曝气机搅拌[43-44].跑道池最大的优点就是成本相对较低,其次是具有可扩展性[43]; 但其缺点也非常明显,主要有单位体积产率低、培养不稳定、易受污染(病原体、原生动物以及杂藻污染等)、不容易监测、水分易蒸发、温度不容易控制等[43,45].由于这些不足所导致的生产问题在实际生产中会造成很多麻烦且很难解决,因此,很少有雨生红球藻生产商在实际生产当中采用该培养系统.值得注意的是,美国夏威夷的Cyanotech公司所采用的跑道池培养系统培养雨生红球藻获得了成功(图2(a)),而国内的荆州天然虾青素有限公司同样采用跑道池培养系统培养雨生红球藻也获得了成功(图(b)).
图片来源:(a)http:∥bigislandnow.com/2012/06/22/
cyanotech-announces-jump-in-earnings/;
(b)http:∥roll.sohu.com/20131014/n388109344.shtml.
图2 跑道池培养系统
Fig.2 Raceway culture systems
管道式光生物反应器主要由培养管、液泵、光源以及冷却装置等组成.培养管的直径通常为5～8 cm[43],材质一般为塑料、玻璃或有机玻璃等透明度高的硬质材料.培养管包括直管和弯管,将这些透明的直管和弯管首尾相连组成类似于管道的体系,并借助外部连接的液泵提供动力,使藻液在反应器内进行混合循环流动,实现藻类的生长.这种培养体系既可以放在室内也可以放置在室外,室内的主要由电灯作为光源提供藻类光合作用所需要的能量,而室外则主要利用太阳光作为光源.
管道式光生物反应器具有生产稳定、高生产率、减少污染、培养条件易于控制等优点[46-48],但其成本、能源消耗和维护费用较高,此外,管内溶解氧及污垢残留等也是该培养体系面临的主要问题[43,49-51].
管道式光生物反应器是最适合户外大规模培养雨生红球藻的光生物反应器之一,目前,全球采用管道式光生物反应器技术进行雨生红球藻生产的厂家中,较为典型的是以色列的Algatechnologies公司(图3(a))以及国内云南省的BGG(图3(b))和爱尔发生物技术股份有限公司(图3(c)).
图片来源:(a)http:∥www.israel21c.org/sun-microalgae-powerful-antioxidant/;(b)http:∥www.nutraingredients-usa.com/
Suppliers2/Chinese-suppliers-angling-to-snare-bigger-share-of-natural-astaxanthin-market;
(c)http:∥www.alibaba.com/product-detail/3-5-astaxanthin-powder-100-natural_60275353682.html.
图3 雨生红球藻生产中的管道式光生物反应器
Fig.3 H. pluvialis cultured in tubular photobioreactors
立柱式光生物反应器是一种高度大于直径2倍以上的圆柱形容器[52],其高度的限制主要与气体传输和柱子透明材料的硬度有关[50].目前,已经报道了各种不同大小的用于微藻培养的立柱式光生物反应器[53-56].立柱式光生物反应器具有组成简单、成本低、易操作、高表面积体积比、混合效果好、剪应力低等优点[50,52,57],但也存在一些缺点,例如表面照射面积少、材料要求高、照射面积随规模扩大而减少等[51].
由于光反应器的光径对于雨生红球藻光胁迫诱导虾青素合成具有重要的影响,而立柱式光生物反应器在高度一定的情况下,其光径大小与体积成正比,因此,该反应器在雨生红球藻“红色”虾青素积累阶段的实际生产应用中受到了一定的限制,例如AzCATI(The Arizona Center for Algae Technology and Innovation)生产雨生红球藻的立柱式光生物反应器(图4(a)),其光径比Algae To Omega Holdings公司的立柱式光生物反应器(图4(b))小得多,但单根柱子的体积也少了很多,而后者尽管每根柱子的体积比前者多,但诱导周期及诱导效果则不如前者.事实上,在实际雨生红球藻生产当中,大型的立柱式光生物反应器更适合用于雨生红球藻生产的“绿色”扩配阶段.
图片来源:(a)http:∥www.algaeindustrymagazine.com/
aim-interview-asus-dr-milton-sommerfeld/;
(b)http:∥algae2omega.com/media/.
图4 雨生红球藻生产中的立柱式光生物反应器
Fig.4 H. pluvialis cultured in bubble column photobioreactors
平板式光生物反应器由于其具有大的光照表面积而备受关注[51].它是一种具有较小光路径的立方体培养容器,主要由一些透明材料,例如玻璃、有机玻璃、聚碳酸酯(polycarbonate,PC)等制成,具有高表面积体积比和更为开放的气体混合系统,与管道式光生物反应器相比,其容器中溶解氧的浓度要低很多[50-52].据报道,平板式光生物反应器可以达到很高的光合效率[58-59],因此很适合微藻的大规模培养; 然而,平板式光生物反应器也存在很大的缺点,例如规模生产需要大量的材料支持,贴壁生产现象严重,放大潜力有限等[48,51].
尽管已经设计并报道了很多种类型的平板式光生物反应器[58,60-62],但在雨生红球藻实际商业生产应用中,由于平板式光生物反应器光径的限制,使得单个平板放大规模有限,这也大大限制了平板式光生物反应器在雨生红球藻实际生产中的应用.目前,在雨生红球藻实际生产应用中,比较有代表性的是AzCATI的平板式光生物反应器(图5(a))以及Fraunhofer IGB公司的平板式光生物反应器(图5(b)).
图片来源:(a)https:∥greenlivingaz.com/little-green-
machines/;(b)http:∥www.igb.fraunhofer.de/en/
competences/environmental-biotechnology/
microalgae/pilot-plant.html.
图5 雨生红球藻生产中的平板式光生物反应器
Fig.5 H. pluvialis cultured in flat panel photobioreactors
薄膜式光生物反应器是指利用具有一定透明度的塑质薄膜材料所制作而成的光生物反应器.塑质薄膜材料具有可塑性大、生产成本低的特点,因此薄膜式光生物反应器可以呈现出各种类型,例如柱式、平板式等,同时也具备了这些类型反应器的优缺点,除此之外,温度控制是薄膜式光生物反应器户外生产所面临的一个主要难题.
由于可塑性大、生产成本低,薄膜式光生物反应器在雨生红球藻的商业应用上也受到了越来越多的关注[63],其中比较有代表性的厂商是Supreme Biotechnologies公司(图6(a))和Maui Tropical Algae Farm公司(图6(b)).
图片来源:(a)http:∥www.ruraldelivery.net.nz/
2014/04/business-growth-in-astaxanthin-production/;
(b)http:∥www.algaeindustrymagazine.com/mtaf-farming-
haematococcus-for-astaxanthin-in-maui/.
图6 雨生红球藻生产中的薄膜式光生物反应器
Fig.6 H. pluvialis cultured in thin-film photobioreactors
半球体式光生物反应器是一种用透明材料制成的半球体式的微藻培养装置,使培养过程中实现无剪应力,适用于微藻的高密度培养[64].通常情况下,半球体的直径为1 m,并配有单独的通气和排气装置,也可根据培养条件附带照明装置[64-65].
目前,全球采用这种技术培养雨生红球藻的公司并不多,其中具有代表性的为AstaReal公司(图7(b)).
图片来源:(a)http:∥www.sciencegates-biotech.com/
facilities.php;(b)http:∥pt.slideshare.net/
supplementalscience/astaxanthin-slides.
图7 半球体式光生物反应器
Fig.7 Hemispheric photobioreactors
贴壁培养技术是一种微藻固定化培养技术,与传统的液体培养不同,贴壁培养是将藻液吸附在支撑材料表面进行固定,然后持续提供微藻生长所需的营养盐,使藻细胞在固定状态下持续健康生长的一种技术[66].这种技术主要解决了传统液体式规模培养中资源浪费、采收困难等问题,同时由于藻细胞固定在材料表面(见图8),完全暴露在空气中,大大地提高了藻细胞的光合效率,因此,具有很大的商业潜力和开发价值.
(a)反应器的内部结构;(b)反应器的外部情况.
![图8 贴壁光生物反应器示意图[68]<br/>Fig.8 The schematic diagram of attached photobioreactor[68]](2016年05期/pic84.jpg)
图8 贴壁光生物反应器示意图[68]
Fig.8 The schematic diagram of attached photobioreactor[68]
![图9 雨生红球藻贴壁培养示意图[67]<br/>Fig.9 The schematic diagram of H. pluvialis cultured in attached photobioreactors[67]](2016年05期/pic85.jpg)
图9 雨生红球藻贴壁培养示意图[67]
Fig.9 The schematic diagram of H. pluvialis cultured in attached photobioreactors[67]
雨生红球藻生产的天然虾青素抗氧化能力强,无毒无污染,且在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业等方面具有广阔的应用前景.目前我国虾青素市场需求巨大,但一直以来,我国在利用雨生红球藻生产虾青素方面的研究还主要围绕在培养基、培养和胁迫条件优化等[68-76]方面的实验室研究,而在中试和规模化生产方面的研究报道较少[77-78],这在一定程度上影响了我国微藻虾青素的产业化进程.最近,李元广团队独创了“异养-稀释-光诱导串联”培养技术,并在雨生红球藻产业化应用方面取得了新的突破性研究[79].相信更多的关于雨生红球藻规模化培养技术方面创新性的研究报道势必会促进我国虾青素行业的发展,加速我国雨生红球藻产业化的进程.
