本研究以粳稻台北309(Oryza sativa ssp.Japonica var.TP309)为实验材料,将水稻幼苗水培至四叶期,选择长势一致的幼苗分成三部分:1)一部分提取叶片基因组DNA和总RNA,用于SIDP301基因的克隆. 2)一部分进行干旱、高盐、低温、高温和H₂O₂胁迫以及脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和赤霉素(GA₃)激素处理,用于逆境表达分析.胁迫处理方法:干旱处理是将正常生长的幼苗断水暴露在空气中; 高盐和H₂O₂处理是分别将幼苗根部浸泡在150 mmol/L NaCl和1%(体积分数)H₂O₂溶液中; 低温和高温处理是分别将幼苗转移至4和42 ℃生长箱,12 h光照/12 h黑暗培养.上述5种非生物胁迫处理均在0,1,3,6,12和24 h分别取样.植物激素处理方法:分别用100 μmol/L ABA、JA、SA、GA₃和20 μmol/L 2,4-D溶液喷洒幼苗叶片,0,0.5,1,3,6和12 h后按不同处理分别取样. 3)剩余一部分幼苗直接移栽至盆土中并置于室外自然条件下生长.待水稻生长至开花期,分别剪取根、茎、茎节、叶、花序和叶鞘用于组织表达模式分析.所有采集样品立即用液氮速冻后置于-80 ℃保存备用.

表1 本研究所用引物
Tab.1 Primers used in this study

SIDP301基因在GenBank中编号为AK108771,在RGAP 6.1(Rice Genome Annotation Project,http:∥rice.plantbiology.msu.edu/)数据库中登录号为LOC_Os04g37530.1,位于水稻第4号染色体上.基因组序列全长2 392 bp,包含1个内含子,长1 038 bp(位于第1 145～2 182位核苷酸),开放阅读框区域长804 bp,编码一个由268个氨基酸组成的蛋白,其中包含一段ZnF_C2H2型锌指结构域(位于第148～172位氨基酸残基)和一段富含半胱氨酸的未知功能的DUF1644结构域(位于第47～202位氨基酸残基).

用PLACE工具(http:∥www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)预测SIDP301基因上游1 000 bp启动子区的顺式元件,发现包括56个组织特异性表达元件、30个ABA响应元件、8个GA响应元件、11个干旱响应元件、12个低温响应元件、4个脱水应答元件等.由此预测该基因可能具有组织表达特异性,并参与多种逆境胁迫和激素的响应.

通过qRT-PCR 方法检测了SIDP301基因在水稻中的组织表达模式,结果如图1所示:SIDP301基因在花序、茎节、茎、根、叶和叶鞘中均有表达,叶鞘中的表达量显著高于其他组织(p<0.05),根和叶中的表达量次之,而在花序中表达量最低,其中在叶鞘中的表达量是花序的10倍以上,这些结果表明SIDP301基因的表达具有组织差异性.

不同小写字母表示差异显著(t-检验,p<0.05).

图1 SIDP301基因的组织表达模式
Fig.1 The tissue expression pattern of SIDP301 gene in O. sativa

利用qRT-PCR方法分析了高盐、干旱、高温、低温和H₂O₂ 5种非生物胁迫条件下水稻幼苗叶片中SIDP301基因的表达模式,结果如图2所示:SIDP301基因明显受H₂O₂、高盐和高温诱导表达,表达量分别在H₂O₂处理12～24 h、

图2 SIDP301基因在非生物胁迫处理下的表达
Fig.2 The expression patterns of SIDP301 gene under abiotic stresses

图3 逆境相关激素处理下的SIDP301基因表达
Fig.3 The expression patterns of SIDP301 gene after the treatments with stress related phytohormones

用同样的方法分析了ABA、SA、JA、2,4-D和GA₃ 5种逆境相关激素处理对水稻幼苗叶片中SIDP301基因表达变化的影响,结果如图3所示:SIDP301基因明显受JA、SA和2,4-D诱导表达,且表达量均在处理6 h时达到最大值; ABA处理对SIDP301基因的表达也有诱导作用,但效果不是很明显; GA₃处理基本不影响SIDP301基因的表达.

通过农杆菌介导的转化方法,分别将构建好的超量表达和抑制表达SIDP301基因的重组质粒导入水稻TP309中,获得相应的转基因植株.对阳性转基因水稻进行qRT-PCR分析,结果显示:目的基因SIDP301在超量表达转基因植株(OE1～10)中的表达均高于野生型(WT)植株,在抑制表达转基因植株(RNAi1～7)中均明显低于WT植株,说明SIDP301基因相应地超量表达或抑制表达(图4).

(a)超量表达转基因植株;(b)抑制表达转基因植株.

图4 T0代转基因植株中SIDP301基因的相对表达水平
Fig.4 Relative expression levels of SIDP301 gene in T0 transgenic plants

通过对转基因植株的耐盐性分析,进一步了解SIDP301基因的生物学功能.挑选萌发一致的WT和转基因水稻种子,分别转移至正常培养基和200 mmol/L NaCl的高盐培养基上生长.结果发现:在正常培养基上,转基因植株与WT植株的表型无明显变化,说明SIDP301基因的超量表达或抑制表达不影响植株的正常生长发育; 在200 mmol/L NaCl的高盐培养基上,OE植株和WT植株的表型没有明显差异,但RNAi植株的长势明显弱于WT植株(图5).对转基因植株和WT植株相应的生长指标进行统计分析,结果发现OE植株的株高和鲜质量与WT植株无显著差异,但RNAi植株的株高和鲜质量与WT植株存在显著差异(图6).这些结果说明SIDP301基因抑制表达的转基因水稻植株表现出对高盐胁迫耐受性的降低.

图5 高盐(200 mmol/L NaCl)胁迫下生长14 d的野生型和转基因植株的表型
Fig.5 Growth performance of transgenic seedlings under 200 mmol/L NaCl stress after transplanting for 14 d

为了进一步说明转基因植株与野生型植株在高盐胁迫下存在的表型差异,利用qRT-PCR分析4个已经鉴定为逆境相关的标记基因(P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1)在转基因植株和野生型植株中的表达情况.结果表明:P5CS、Rab16a和Lea3-1的表达量在OE植株中显著高于WT植株,DREB2A的表达量在OE植株中略高于WT植株; 然而,在RNAi植株中P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1的表达量均略低于WT植株.

基因表达调控是现代分子生物学研究的重要课题之一.了解基因表达的时空表达变化及其表达调控机制,可以更好地理解生物的生长发育规律、形态结构特征及生物学功能.DUF1644基因家族是植物中一个高度保守且功能未知的基因家族,其蛋白保守结构域包括160个氨基酸残基,其中含有9个高度保守的半胱氨酸残基^[12],推测为一个转录因子家族,该家族蛋白含有低复杂度(low complexity)区域、DUF1644结构域、ZnF_C2H2型锌指结构域和环状结构域(RING).DUF1644结构域的功能仍然未知,可能与锌离子的结合有关.ZnF_C2H2型锌指结构域是最多也是研究最为清楚的一类锌指蛋白,主要涉及植物的生长发育和对环境胁迫的应答反应^[13].

Li等^[3]对DUF1644家族的SIDP361基因研究表明,该基因在水稻的根和叶中的表达水平较高,受高盐、干旱和ABA诱导表达,但对高温、低温和H₂O₂、JA以及SA处理不敏感.Guo等^[4]对同家族基因SIDP366的研究结果显示,该基因主要在水稻的根、茎、叶、花药中表达,并且参与了种子的成熟过程,同时该基因还受盐、干旱、高温、H₂O₂、ABA和SA胁迫的诱导表达.SIDP301基因与SIDP361和SIDP366同属于DUF1644家族,它们的表达模式可能相似.为了验证这个假设,本研究对SIDP301基因的表达模式进行了分析,结果表明该基因在水稻的根和叶中的表达量高于其他组织,且其表达受高盐、高温、H₂O₂、SA、JA和2,4-D的诱导,但不受干旱、低温和GA₃胁迫处理的影响.尤其是在受到高盐胁迫处理后,SIDP301基因的表达量在短期内迅速上升,最高可以达到处理前的10倍以上,可见其表达对高盐胁迫的每个实验重复3次,每次重复10个样品; *表示转基因植株和野生型植株之间呈显著差异(t-检验,p<0.05).

图6 转基因植株和野生型植株在高盐(200 mmol/L NaCl)胁迫下的株高(a)和鲜质量(b)
Fig.6 Plant height(a)and fresh mass(b)of transgenic plants and WT plants under 200 mmol/L NaCl stress

图7 非生物胁迫相关基因在转基因植株中的相对表达水平
Fig.7 Relative expression levels of the abiotic stress-related genes in transgenic plants

SIDP301基因有一个ZnF_C2H2型锌指结构域,该结构域主要涉及植物的生长发育和对环境胁迫的应答反应^[14].逆境表达模式结果显示SIDP301的表达明显受盐胁迫诱导,同时该基因启动子上存在多个胁迫相关的顺式作用元件.为确定SIDP301是否参与调控水稻的耐盐性,对SIDP301转基因植株幼苗进行了耐盐性分析,发现超量表达SIDP301的转基因T₁代水稻的株高、鲜质量与WT植株相比并没有显著变化(t-检验,p>0.05),但抑制表达SIDP301的转基因植株与WT植株相比,株高和鲜质量均显著降低(t-检验,p<0.05),表现出对高盐胁迫更加敏感.有所不同的是,同一家族的SIDP361^[3]和SIDP366^[4]基因的超量表达转基因植株均表现出对高盐胁迫的耐性增强,抑制表达植株均表现出对高盐胁迫的耐性降低.

为了解释SIDP301转基因植株与WT植株在高盐胁迫下存在的表型差异,本研究分析了一些逆境相关标记基因的表达变化,如:P5CS、DREB2A、Lea3-1和Rab16a.SIDP301基因的超量表达上调了P5CS基因及信号通路下游Lea3-1基因的表达,且Rab16a的表达上调尤其强烈.这些基因的表达促进了水稻体内渗透调节物质以及保护水稻细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白的积累,可以提高水稻对高盐的耐受性.而SIDP301抑制表达转基因植株中,P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1的表达量与WT植株中相比没有显著差异.这些结果说明SIDP301是一个抗逆相关基因,在高盐条件下主要通过上调下游信号通路基因的表达发挥功能.